Struttura e funzione degli Acidi Nucleici materiale didattico

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Struttura e funzione degli Acidi Nucleici
materiale didattico disponibile su
http://homepage.sns.it/tozzini/didattica.html
Sommario
Tipi e funzioni degli acidi nucleici
Struttura primaria
Struttura secondaria
Struttura terziaria
๏ superavvolgimenti nel DNA
๏ tipiche strutture e tipi di RNA
❖ Struttura quaternaria
๏ nucleosomi e cromatina
๏ ribosomi
๏ nanostrutture di acidi nucleici
❖
❖
❖
❖
composizione
carboidrati C O H
lipidi
COHP
acidi
nucleici
COHNP
Proteine
COHNS
(P Ca Na Cl …)
struttura
funzioni
monomeri
energetiche
oligomeri
omopolimeri
strutturali
monomeri
energetiche
strutture complesse
strutturali
monomeri
energetiche
strutturali
enzimatiche
regolatrici
Informative (conservazione e
trasmissione del genoma)
eteropolimeri
strutture complesse
monomeri
eteropolimeri
strutture complesse
energetiche
strutturali
enzimatiche
trasporto
protezione
regolatrici
Informative (proteoma)
❖DNA Acido Desossiribonucleico
๏Conservazione e trasmissione dell’informazione genetica
๏Ruoli strutturali
❖RNA Acido Ribonucleico
๏Ruoli regolatori in trascrizione, traduzione, replicazione…
๏Catalisi, riconoscimento e altri ruoli funzionali
๏Ruoli strutturali
๏Conservazione e trasmissione dell’informazioni (solo in alcuni virus)
⇒ E` esistito un mondo ancestrale in cui esisteva solo RNA?
Perché attualmente DNA e RNA hanno ruoli diversificati?
Quali sono le caratteristiche strutturali che li rendono cosí diversi?
Componenti base
Acidi Nucleici = etero-poli-nucleotidi
2H+
_
❖Il gruppo fosfato è CARICO 2- !
❖Il D(R)NA è ACIDO e CARICO!!
Nucleotide
= pirimidin(purin)-(2’desossi)ribosil-monofosfato
= nucleoside-monofosfato
nucleoside = pirimidin(purin) -(2’desossi)ribosio
citidina
adenosina
timidina
uridina
(desossi-)nucleosidi
pseudo-uridina
5-metil uridina
(ribotimidina)
guanosina
Nucleosidi
nonstandard
Nucleosidi
standard
Oltre ai nucleosidi standard che si trovano in DNA o RNA o
in entrambi, in specifiche locazioni di tRNA (e altri RNA), e
con specifiche funzioni possono trovarsi nucleosidi non
standard sintentizzati da reazioni auto-catalitiche posttrascripzionali (pseudo e 5metil uridina) oppure inosina
derivante dall’adenosina, che forma accoppiamenti non
standard (wooble pairs)
RNA ha maggiore variabilità strutturale di DNA
inosina
Anche la parte fosfato-zucchero (scheletro) dell’acido
nucleico può variare, dando vita ad altri tipi di NA
a. Acido Treosio Nucleico TNA
b. Acido Peptide Nucleico PNA (neutro)
c. Acido Glicerol Nucleico GNA
d. Piranosil RNA (pRNA)
Altri tipi di NA
Artificiali (sintesi biochimica)
Possibili precursori naturali in un mondo pre-RNA
TNA
Semplice da
sintetizzare
Usato come
precursore di
RNA
PNA
Scheletro affine a
quello dei polipeptidi
Neutro, piú stabile e
con accoppiamenti
piú forti. Usato nella
terapia genica
LNA (locked)
RNA modificato per
bloccare il ribosio in
configurzione tale da
favorire stacking e
sintesi di nucleotidi
lunghi
pRNA
Avvitamento
GNA
minore di DNA e
Accoppiamenti RNA, struttura
forti
piú aperta e
prona alla
separazione dei
due filamenti
Morpholino
Usato in
ingegneria
genetica per
controllare
l’espressione
genica
Funzione energetica: ATP-ADP-AMP
ATP + H2O → ADP + Pi
ΔG˚ = −7.3 kcal/mol
ATP + H2O → AMP + PPi ΔG˚ = −10.9 kcal/mol
PPi=pirofosfato
P2O74-
Pi=fosfato
PO43-
L’idrolisi di ATP in ADP (AMP)
libera grandi quantità di
energia, ed è una reazione
relativamente semplice
⇒ l’ATP è tra le piú diffuse
“monete di scambio”
energetico nei viventi
❖ΔG˚ è il valore in condizioni
standard di presione e volume (STP)
e a concentraizone 1M
❖ΔG in ambiente cellulare (tenendo
conto di forza ionica e altri effetti)
assume un valore medio −14kcal/
mol
Polymerization reaction
+
Polynucleotide (N) + nucleoside triphosphate
+ energy
(~6kcal/mole)
→
pyrophosphate
+ Polynucleotide (N+1)
Phosphodiester linkage
(3’C and 5’C = esterification positions of (deoxy)-ribose)
The reaction occurs catalyzed by DNA or RNA polymerases at the 3’ end
The polynucleotide:
❖is stable versus nucleoside-triphosphates
❖has a net negative charge ⇒ macroscopic structure strongly
dependent on the hydration / ionic strength of the solution
❖has a directionality: sense(+) or antisense(-) exist
Hydrolysis
H 2O
+
+ energy (~20 kcal/mole)
H 2O
OH
OH
OH
❖The polynucleotide is meta-stable versus the hydrolysis in nucleotides,
although the activation barrier is very high for DNA (“almost stable”)
⇒An example of the fact that the cell is an out of equilibrium system
⇒Transient dynamical equilibria are maintained by a continuous incoming
energy flow
❖The activation barrier is lower for RNA due to the OH group ⇒ RNA is
less stable ⇒ Much shorter chains
The genetic code
❖The primary structure (sequence) contains the information to build the sequence of
amino-acids (proteins) genome ⇒ proteome
❖The information is codified in triplets of bases (codons)
❖The information is redundant: 4x4x4 triplets for 20 AA ⇒ protection against mutations
ØBoth RNA and DNA can be
used to store information, but
DNA is more safe, due to the
presence of the double helix
and to the larger stability ⇒ it
is dominantly used by almost
all the self-replicating systems
ØIn any case, the RNA is used
for the protein synthesis, thus
the DNA must be first copied
into RNA to be used
(transcription)
WC pairing
A-T and C-G
Secondary str - Base pairing
RNA
DNA
WC pairing
A-U and C-G
2 h-bonds
3 h-bonds
RNA
Wooble pairing
Inosine
Hoogsten pairing
DNA-RNA
Secondary str - Base pairing
~10.5 kcal/mol DNA
~11.0 kcal/mol RNA
In both cases the formation enthalpy
is slightly larger than the sum of the
hydrogen-bond energies because of
environmental and cooperative
effects, stacking interactions…
(X)
~6.5 kcal/mol DNA
~7.0 kcal/mol RNA
(Uracil)
Sugar in C2’-endo conformation
❖The typical DNA conformation, in normal
hydration and salt concentration, for
average DNA compositions
❖Long and thin
❖Major and minor grooves clearly
distinguishable
❖More prone to bending
B-DNA
X
A-DNA
RNA
Double helices
Sugar in C3’-endo conformation
❖The only possible double helix
conformation in RNA, that is, however,
usually found in single short strands
❖in DNA:
๏at high salt concentration or low
hydration
๏for specific sequences (homo-purine
or pyrimidine segments)
๏ when DNA interacts with proteins or
RNA
❖Larger and shorter
❖More rigid
Z-DNA
❖Only in DNA, for alternate purinepirimidine seq
❖Long and thin
❖Zig-zag backbone
❖Alternate exo-endo C2’
❖Alternate syn-anti orientation of
bases
Quadruplexes
❖DNA, RNA and hybrid RNA-DNA
❖Short helix segments or junctions
❖Stabilized by Hoogsten pairing
alternative helix conformations
Triple helices
Hoogsten
WC
❖ DNA, RNA and hybrid RNA-DNA
❖A-like conformation
❖Stabilized by WC and Hoogsten
pairing
Summary of helix geometries
Senso dell'elica
Unità ripetuta
Conformazione dello zucchero
A-DNA
destrorso
1 bp
C3’-endo
B-DNA
destrorso
1 bp
C2’-endo
Orientazione delle basi
anti
anti
Rotazione/bp
bp medie/giro
Inclinazione delle bp rispetto all'asse
Passo/bp lungo l'asse
Passo/giro d'elica
Propeller twist medio
Diametro
Lunghezza di persistenza
33.6°
10.7
+19°
2.3 Å
24.6 Å
+18°
25.5 Å
~60 nm
35.9°
10.0
-1.2°
3.32 Å
33.2 Å
+16°
23.7 Å
~50 nm
Persistence length = measure of the stiffness
< tx ⋅ tx+ l > x =< cosθ > x = exp(− l / P)
tx
Z-DNA
sinistrorso
2 bp
Pirimidine C2'-endo
Purine C2'-exo
Pirimidine: ant i
Purine: sy n
-60°/2bp
12
-9°
3.8 Å
45.6 Å
0°
18.4 Å
θ
l
t x +l
Other helix conformations are possible, but rare
C, D, E, H, L, S, P -DNA
Their stability depends on the €
enviroment conditions and on the composition
€
Stabilità della doppia elica
Variazione dell’energia libera di Gibbs per separazione dell’elica (denaturazione)
entalpia intrinseca
ΔG = ΔH − TΔS = 0
entalpia
⇒
entropia
ΔH
ΔH 0
Tm =
= 0
ΔS ΔS + Rln(Ct ) + A
Temperatura di
denaturazione
Correzione per l’autocomplementarietà
Variazione di entropia dovuta alla concentrazione
entropia intrinseca
€
❖Nel modello “primi vicini” ΔS0 e ΔH0 vengono calcolati assumendo che i contributi
dei singoli nucleotidi aggiunti alla catena siano semplicemente additivi e quindi
dipendano solo dal numero e tipo di coppie di basi nCG nTA
❖I parametri delle funzioni ΔH 0 (nCG ,nTA ) e ΔS 0 (nCG ,nTA ) sono determinati
sperimentalmente per DNA e RNA
⇒ La temperatura di denaturazione può essere
calcolata per DNA e RNA di diverse
€
€
lunghezze e composizioni e in funzione della concentrazione
€
€
6-bp 20-bp
50-bp 500-bp
Formula per DNA semplificata (per catene lunghe)
Tm = 81.5 + 41(nCG /n) − 500 /n + 16.6log(M)
RNA
DNA formula esatta
DNA formula semplificata
€
€
n = nCG + nTA
Ionic strength correction
❖Tm aumenta con l’aumento della percentuale
di coppie CG ⇒ il legame CG è piú forte del T
(U)A, la differenza è dovuta al legame H in piú
❖A parità di composizione, Tm è maggiore per
catene piú lunghe ⇒ la denaturazione è un
processo favorito dalle estremità libere o da
bolle di denaturazione
❖A parità di composizione, Tm è maggiore per
RNA; inoltre RNA è piú rigido ⇒ la struttura
3D di RNA è piú stabile di quella di DNA, in
accordo con il fatto che RNA ha piú spesso
ruoli strutturali e funzionali di DNA
❖Invece, la doppia elica di DNA è piú
propensa alla separazione in singoli filamenti,
fatto necessario per nei processi di
replicazione
Other secondary structures
DNA
only and rarely the
quadruple junctions
RNA
all possible, and
frequent
Tertiary structures:
DNA supercoiling
Twist T
Writhe W
= torsion around the axis = contorsion of the axis
T and W both contribute to the global torsional stress of the molecule
(linking number) L=T+W
Plasmidi = tratti di DNA, solitamente
circolare, estracromosomici, capaci di
replicazione autonoma, presenti in batteri
e animali superiori, codificanti proteine con
varie funzioni, solitamente “difensive”
Nel DNA circolare L=T+W è un invariante
topologico (costante)
⇒
se T rilassa verso il valore nullo (struttura
non ritorta), l’asse deve attorcigliarsi (W
cresce) ⇒ supercoiling
Ma anche nel DNA non circolare, le
estremità sono di solito fissate
⇒L=T+W=cost
⇒Il supercoiling è molto comune.
Ad esempio, nella cromatina è
responsabile dell struttura
solenoidale
Supercoling nei plasmidi
Superhelical density
σ = ΔL / L0
ΔL = L − L0
Superhelical density
L=linking number = global number of turns
unstressed value
The superhelical density assumes a universal value in plasmids
σ ≈ −0.06 and in both eukaryotic and procariotic chromosomes
€ ⇒ This value has to€have some functional property
… and transcription
Negative supercoiling favors denaturation…
F. Trovato et al 2008
Why σ=-0.06?
❖Supercoiling (positive or negative) is necessary for DNA compaction
❖A positive value of supercoiling stabilizes the double helix
❖A slightly negative value of the super-helical
density favors the double helix separation
⇒balance between compaction and metastability of the double helix to aid the
polymerases action during transcription
σ=-0.06 is maintained by topoisomerases, that
break and rebuild the double helix when
torsional stress is excessive
RNA tertiary structure
Secondary structure motifs (double helices, hairpin bulges, single
strands) are coupled by WC or non-WC base pairing…
pseudoknot
kissing loops
kissing hairpins
knot
… and fold in a stable and specific 3D shape
RNA
DNA
Stable shape makes possible
specific functionality
❖recognition
❖catalysis
❖regulation
❖…
Rather fluctuating tertiary structure
Weak negative supercoiling
Delicate balance to maintain the
double helix weakly metastable and
favor the strand separation
DNA replication
❖DNA double strands separate in single strands
❖Each single strand can be duplicated (replication) in a
complementary strand
Espressione del DNA
1.Trascrizione (transcription)
ØL’RNA-polimerasi si lega al DNA in
corrispondenza di specifiche sequenze (promotori)
Øsvolge e separa il DNA
Øcopia uno degli filamenti (template) in RNA
messaggero (mRNA) tramite complementarietà WC
⇒ mRNA è uguale all’altro filamento (il codificante)
apparte la sostituzione U→T
1.Da ogni gene viene prodotto un singolo tratto di
mRNA
2. Traduzione (translation)
Dopo un’eventuale maturazione (solo negli
eucarioti) l’mRNA viene letto e decodificato
dal Ribosoma, che procede anche alla sintesi
della catena proteica
Nel processo di traduzione sono coinvolti diversi tipi di RNA
❖mRNA: lungo singolo strand destrutturato che porta l’informazione genetica
❖tRNA (transfer RNA) piccolo strand strutturato che porta legato ad una estremità
un amminoacido
❖rRNA (RNA ribosomiale) che insieme a catene proteiche fa parte del ribosoma
stesso e ha ruoli funzionali
The ribosome
Large subunit
Small subunit
Tertiary structures: tRNA
tRNA
amino-acid
binding site
anticodon
5’
codon
3’
mRNA
ribosome
Codon= codifying triplet in mRNA
Anticodon= complementary de-codifying triplet in tRNA
The tRNA binds the codon at one side and the amino-acid at the other side
⇒tRNA is the decoding key of the genetic code
(correspondence between base triplets and amino-acids)
Ribozimi
Enzimi a RNA che catalizzano generalmente rottura o formazione di legami
fosfodiestere. Ne sono stati sintetizzati di artificiali che catalizzano molte altre reazioni
(anche la polimerizzazione)
HDV ribozyme
hairpin
hammerhead
❖Function: (self-catalytic) sequence-specific breaking of the phosphodiester
bond by isomerization
❖Occurrence: in virus, viroids, satellites
Self-splicing intron
Present in pre-mRNA
self catalytically separates its own
exons (splicing)
Ribonuclease P maturates the precursor of tRNA,
cleaving off an extra sequence
In order to solve their functions, functional RNAs
must have a well defined 3D structure
Aptameri
Frammenti oligonucleotidici di DNA o RNA con sequenza e conformazione specifica per
il riconoscimento di molecole bersaglio
Quelli artificiali sono creati tramite procedure di maturazione e
selezione per affinita` al bersaglio, ma ne esistono anche di
naturali nei cosiddetti “riboswitch” cioe` frammenti di mRNA
che legano a specifiche molecole e in seguito al legame
promuovono o bloccano la trascrizione in presenza di alte
concentrazioni di specifiche sostanze (attivita` regolatoria)
Il riconoscimento è basato su stacking, ingombro sterico, reti
di legami H.
Aptamero della neomicina:
riconoscimento per stacking e legame
H
Riboswitch della lisina
Aptamero di ATP: L’adenosina si inserisce
in un sito che completa un tetraloop
Struttura e funzione degli Acidi Nucleici Quaternary structure
Ribosome RNA (rRNA)
The ribosome quaternary structure
Size: About 25 nm
~ 50 chains
(proteins or nucleic acids)
Nucleosomes and chromatin
Compaction occurs through a hierarchical organization
Chromatin compaction-decompaction
Chromatin is usually compacted in chromosomes
But needs to be sparse in the nucleus for the DNA
duplication to take place
The compacted/sparse transition is
regulated by the histones
❖The long histone tails are chemically transformed
(acetylated, methylated …) by specific environmental
signals
❖The histones change their structure/properties and
induce DNA winding-unwinding
❖The chromatine change its compaction state
Riassunto delle differenze tra DNA e RNA
DNA
Meccanismi di
stabilità-degradazione
Denaturazione
Nucleotidi
Basi
Struttura primaria
Tipo di accoppiamenti
tra basi
Conformazione del
backbone
Eliche
Lunghezza di
persistenza
Altri tipi di struttura
secondaria
RNA
Scarsa propensione all’idrolisi della
catena
Propensione a subire danni dai raggi
UV
Temperatura di denaturazione tra 30 e
110 gradi, dipendentemente da
lunghezza e composizione
Fosfato + desossiribosio + base
azotata
Adenina Guanina Timina Citosina
Alta propensione all’idrolisi della catena
Catene molto lunghe, mediamente
intorno ai 100 milioni di bp (~3 cm)
Principalmente accoppiamenti WC
Catene relativamente corte, mediamente 20
-100 nucleotidi
Accoppiamenti WC, wooble pairs,
accoppiamenti di Hoogsten
Zucchero in conformazione esclusivamente
C3-endo
solo A-RNA
Zucchero in conformazione C2-endo (in
BDNA) oppure in C3-endo (in ADNA)
Conformazione principale: B-DNA
A bassa idratazione: A-DNA
Raramente, Z-DNA
~50nm
Suscettibilità di mutazione di C in U con
formazioni di wooble pairs
A parità di lunghezza e composizione,
temperatura di denaturazione mediamente
piú alta di circa 10 gradi
Fosfato + ribosio + base azotata
Adenina Guanina Uracile Citosina Inosina
~60nm
Piccoli tratti di triple o quadruple eliche Tratti di elica disaccoppiata, hairpins,
Giunzioni di Hoilyday
bulges, internal loops, giunzioni
DNA
Struttura terziaria
Superavvolgimenti
Struttura quaternaria
Nucleosomi, …
Tipi principaliorganizzazione
DNA codificante (e non)costituente il
genoma, organizzato in cromosomi o
plasmidi
Conservazione e trasmissione
dell’informazione genetica
Ruoli strutturali (centromeri, telomeri)
Funzioni
RNA
Accoppiamenti estesi tra strutture
secondarie tramite base pairing, knot e
pseudoknot, eliche triple, accoppiamenti
paralleli tra eliche.
Ribosomi, …
mRNA, tRNA, ribozimi e altri tipi di RNA
funzionale. RNA ribosomiale (rRNA). RNA
codificante in virus
Conservazione e trasmissione
dell’informazione in alcuni virus. Trasporto
dell’informazione all’interno della cellula
(mRNA, tRNA).
Ruoli funzionali nella duplicazione,
trascrizione, traduzione del DNA o di RNA
codificante, ruoli enzimatici (ribozimi) o altri
ruoli funzionali
❖ l’RNA forma strutture terziarie e quaternarie piú stabili che DNA
⇒ adatto anche per ruoli funzionali e strutturali
❖Il DNA non ha strutture terziarie ben definite, ma ha catene molto piú lunghe
e la doppia elica è facilmente denaturabile
⇒ ottimizzato per mantenere e trasmenttere correttamente l’informazione
genetica
RNA world and beyond
❖L’RNA ha ruoli: 1. energetici 2. informativi 3. funzionali (riconoscimento,
catalisi varie, polimerizzazioni)
❖È stata mostrata la possibilità del’evoluzione autonoma di in vitro di alcuni
ribozimi complessi, ad esempio con funzioni di polimerasi
❖È possibile che si siano evoluti da nucleotidi base i primi sistemi basati solo
su RNA capace di autoreplicarsi, avviando processo di selezione naturale
(competizione verso la capacità replicatoria e la complessità)
❖Il DNA sarebbe successivamente evoluto dall’RNA per migliorare le
prestazioni relative al mantenimento e trasmissione dell’informazione
❖Dai primordiali ribozimi possono essersi evoluti primitivi ribosomi, dando vita
alla sintesi proteica. Le proteine avrebbero poi soppiantato l’RNA come
strumenti ottimizzati per i compiti strutturali e funzionali
❖Altre molecole senza capacità informative si sarebbero specializzate in ruoli
energetici e strutturali
L’ipotesi del mondo RNA è molto seducente, ma non è noto a tutt’oggi nessun
meccanismo di sintesi “spontanea” per le basi pirimidiniche, né per la
formazione dei nucleosidi, né per la loro fosforilazione in nucleotidi, mentre
invece possono formarsi basi puriniche
DNA and RNA nanostructures
❖Self-assembly (WC pairing recognition)
❖Modularity
⇒Nanobioelectronics, structural biosynthesis, nanostructuristics …
DNA
RNA
based on a few struct motifs
more natural structural motifs

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