Polimorfismi HLA nella popolazione della

Polimorfismi HLA nella popolazione della provincia
di Cuneo: analisi di alleli ed aplotipi estesi
Giuseppe Menardi(1), Laura Perotti(1), Sabina Rendine(2), Riccardo Balbo(1),
Dario Marenchino(1), Paola Abello(1), Gianmichele Peano(1)
(1)
(2)
Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale, ASO Santa Croce e Carle, Cuneo
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica, Università di Torino, Torino
The high polymorphism of the HLA system has been
used for anthropological, epidemiological and
population genetic studies.
By studying the characteristic frequencies of alleles
and extended HLA haplotypes in different populations,
it is possible to inquire into ethnic groups and establish
genetic relationships among them. In the present study,
HLA-A,-B,-C, and HLA-DR,-DQ serological typing has
been used for the first time to assign specific HLA
alleles and haplotypes frequencies to the population of
the Province of Cuneo and compare them with the
frequencies of other Italian and French populations.
Allelic and three-locus haplotype frequencies place the
population of the Province of Cuneo closer to southFrench populations than to other Italian groups.
Parole chiave: HLA, aplotipi estesi, genetica di
popolazione.
Key words: HLA, extended haplotypes, population
genetics.
Introduzione
Il complesso maggiore di istocompatibilità (MCH) è una
delle regioni più intensamente studiate del genoma umano.
Più di cento geni sono stati localizzati all'interno di questa
regione di quattro Mb sul braccio corto del cromosoma sei,
tra cui i geni del sistema HLA, senza dubbio il più
polimorfico dei sistemi finora studiati.
Per questo motivo, l'analisi del polimorfismo HLA e delle
frequenze alleliche HLA si è rivelata utilissima, oltre che
nell'attività di trapianto e nell'applicazione forense, anche
Ricevuto: 15 dicembre 2000 - Accettato: 22 gennaio 2001
Corrispondenza:
Dott. Giuseppe Menardi
Via Santo Stefano, 13
12040 Morozzo (CN)
nello studio della diversità genetica delle popolazioni e
dell'evoluzione umana.
A questo proposito, a conclusione dell'analisi dei
polimorfismi genetici della Provincia di Cuneo, dopo i
precedenti studi pubblicati su questa rivista sulle frequenze
geniche dei principali sistemi gruppo-ematici1,2, presentiamo
i dati delle frequenze geniche del sistema HLA di classe I:
HLA-A,-B,-C e di classe II: HLA-DR,-DQ, di donatori di
sangue e di midollo osseo che fanno capo al Servizio di
Immunoematologia e Medicina Trasfusionale (SIMT) di
Cuneo.
A questa popolazione corrisponde, dal punto di vista
geografico, tutto il bacino della Provincia di Cuneo, in
quanto anche i donatori degli altri SIMT ed Antenne
Trasfusionali della Provincia fanno capo, per quanto
riguarda la tipizzazione HLA, al SIMT di Cuneo.
Si tratta, come avevamo sottolineato negli studi
precedenti, di una popolazione discretamente omogenea,
di cultura provenzale alpina, che in pianura si è mescolata
con il ceppo di lingua piemontese e, nell'albese più che in
altre parti, con una recente immigrazione da altre regioni
italiane.
Di essa abbiamo studiato un campione costituito da
quattrocento donatori, sani, non imparentati e di origine
cuneese, su cui abbiamo valutato le frequenze fenotipiche,
alleliche ed aplotipiche dei loci del sistema HLA -A,-B,-C,DR e -DQ.
A differenza degli studi precedenti1,2, dato l'alto numero
di alleli che contraddistingue il sistema HLA, non è stato
possibile suddividere il campione in base alle diverse aree
geografiche di cui la Provincia è composta.
Abbiamo poi confrontato le frequenze geniche ed
aplotipiche con quelle italiane e di altre popolazioni vicine
dal punto di vista geografico o culturale, apparse in studi
precedenti.
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 3 maggio-giugno 2001 (173-178)
173
G Menardi et al.
Tabella I: antigeni del sistema HLA esaminati per singolo locus nella popolazione
della Provincia di Cuneo
Locus A
A1
A2
A3
A23
A24
A25
A26
A34
A66
A11
A28
A29
A30
A31
A32
A33
Locus B
B51
B52
B7
B8
B44
B45
B13
B14
B62
B63
B75
B76
B77
B38
B39
B57
B58
B18
B49
B50
Locus C
B54
B55
B56
B27
B35
B37
B60
B61
B41
B42
B46
B47
B48
B53
B59
B67
B70
B73
Cw1
Cw2
Cw3
Cw4
Cw5
Cw6
Cw7
Cw8
Locus DR
Locus DQ
DR1
DR2
DR3
DR4
DR11
DR12
DR13
DR14
DR7
DR8
DR9
DR10
Materiali e metodi
Sono stati tipizzati 400 donatori di sangue o di midollo
osseo non imparentati, scelti in modo casuale, di origine
cuneese almeno fino alla seconda generazione, di cui 210
afferenti al SIMT di Cuneo, 151 al SIMT di Savigliano, 26 al
SIMT di Mondovì e 13 all'Antenna Trasfusionale di Alba.
La tipizzazione HLA è stata eseguita con tecniche
sierologiche per antigeni broad e per splits, con la classica
metodica NIH in microlinfocitotossicità secondo Terasaki3,
con piastre del commercio, per gli antigeni HLA–A,-B,-C,DR,-DQ elencati in tabella I.
In 201 donatori (50,2%) la tipizzazione sierologica DR e
DQ è stata confermata in biologia molecolare con la
tipizzazionedeigeniHLA–DRB1,-B3,-B4,-B5,-DQB,mediante
TaqI RFLP4, o con la metodica di amplificazione locus
specifica del secondo esone della classe II ed ibridazione
con oligonucleotidi sequenza specifici (PCR–SSO)5.
DQ1
DQ2
DQ3
DQ4
valori osservati ed attesi, ed ha una distribuzione χ2 con un
numero di gradi di libertà uguale al numero di fenotipi
osservati meno il numero di frequenze geniche stimate8.
Per misurare la variabilità genetica è stato calcolato il
valore di eterozigosità9. Per ciascun locus è stata calcolata
l'omozigosità attesa (H) sommando il quadrato delle
frequenze dei geni su tutti gli alleli, per cui la eterozigosità
attesa (h) risulta: h = 1 – H
Risultati
Analisi statistica
Frequenze geniche HLA-A,-B,-C
Le frequenze geniche HLA–A,-B,-C della popolazione
studiata sono riportate nella tabella II.
Al locus HLA–A l'allele più frequente risulta essere A2
(27,9%), seguito da A3 (13,8%) e A24 (13,4%).
Al locus HLA–B gli alleli più frequenti sono B35 (15,9%)
e B44 (14,7%).
Al locus HLA–C l'allele più frequente è Cw7 (18,3%)
seguito da Cw4 (18%).
Le frequenze geniche ed aplotipiche sono state
calcolate con il metodo della massima verosimiglianza6,7.
L'adattamento delle frequenze osservate a quelle attese
secondo la legge di Hardy-Weinberg è stato valutato
mediante la statistica G2, meno sensibile alla presenza di
frequenze attese molto piccole della più nota statistica χ2.
La statistica G2 è definita dall'espressione G2 = 2 ∑i [O i
ln(O i /A i)], dove O i e A i rappresentano rispettivamente i
Frequenze geniche HLA–DR e –DQ.
Le frequenze geniche di HLA–DR e -DQ sono riportate
in tabella III.
Al locus HLA–DR non esiste un allele più frequente,
ma bensì un gruppo di alleli (DR1, DR2, DR7, DR11 e DR13)
con frequenze comprese tra 11% e 17%.
Al locus HLA–DQ l'allele più frequente risulta DQ1
(45,5%).
174
Frequenze HLA nel Cuneese
Tabella II: frequenze alleliche HLA-A, -B, -C con relativi valori di G2 e di eterozigosità nella popolazione della provincia di Cuneo
Locus A
A1
A2
A3
A23
A24
A25
A26
A34
A66
A11
A28
A29
A30
A31
A32
A33
A Blank
Frequenze
alleliche
0,1000
0,2789
0,1383
0,0253
0,1340
0,0126
0,0487
0,0013
0,0013
0,0593
0,0434
0,0553
0,0292
0,0228
0,0448
0,0228
0,4390
Locus B
Tabella III: frequenze alleliche HLA-DR, -DQ con relativi
valori di G2 e di eterozigosità nella popolazione
della provincia di Cuneo
Frequenze
alleliche
DR1
0,1070
DR2
0,1574
DR3
0,0808
DR4
0,0821
DR11
0,1724
DR12
0,0138
DR13
0,1311
DR14
0,0448
DR7
0,1559
DR8
0,0434
DR9
0,0038
DR10
0,0075
DR Blank
0,0330
G2 (gdl 66) = 68,17 p≥0,05
Eterozigosità
0,875
Locus C
B51
0,1070
B52
0,0088
B7
0,0767
B8
0,0606
B44
0,1471
B45
0,0038
B13
0,0215
B14
0,0513
B62
0,0474
B63
0,0138
B75
0,0000
B76
0,0000
B77
0,0000
B38
0,0266
B39
0,0202
B57
0,0318
B58
0,0075
B18
0,0686
B49
0,0189
B50
0,0228
B54
0,0000
B55
0,0215
B56
0,0038
B27
0,0253
B35
0,1589
B37
0,0164
B60
0,0215
B61
0,0126
B41
0,0013
B42
0,0000
B46
0,0000
B47
0,0050
B48
0,0000
B53
0,0101
B59
0,0000
B67
0,0000
B70
0,0050
B73
0,0000
B Blank
0,0266
G2 (gdl 378) = 332.194 p ≤ 0,05
0,919
G2 (gdl 120) = 120.722 p ≥ 0,05
Eterozigosità
0,867
Locus DR
Frequenze
alleliche
Locus DQ
DQ1
DQ2
DQ3
DQ4
DQ Blank
Frequenze
alleliche
0,4546
0,2063
0,2964
0,0382
0,1600
G2 (gdl 6) = 6,51 p≥0,05
0,663
Frequenze
alleliche
Cw1
Cw2
Cw3
Cw4
Cw5
Cw6
Cw7
Cw8
Cw Blank
0.0202
0,0526
0,0835
0,1799
0,0646
0,0862
0,1830
0,0292
0,4390
G2 (gdl 36) = 56.08 p ≥ 0,05
0,821
Tabella IV: frequenze aplotipiche stimate degli aplotipi
estesi HLA A, B, DR nella popolazione di
Cuneo
Aplotipi
A29
A1
A24
A2
A23
A2
A3
A11
A24
A2
A2
A2
B44
B8
B35
B51
B44
B44
B7
B35
B18
B44
B51
B35
Frequenze
DR7
DR3
DR11
DR11
DR7
DR4
DR2
DR1
DR11
DR7
DR7
DR1
0,0235
0,0211
0,0153
0,0138
0,0125
0,0117
0,0115
0,0110
0,0106
0,0105
0,0104
0,0102
Nella tabella sono indicati solo gli aplotipi con frequenza superiore
a 0,01.
175
G Menardi et al.
I valori di G2 sono risultati non significativi per tutti i
loci eccetto per HLA-B (332,194 con 378 gradi di libertà)
dovuto al numero elevato di alleli in questo locus.
Frequenze degli aplotipi estesi HLA A,B,DR.
Come elencato nella tabella IV, 10 aplotipi estesi risultano
con una frequenza superiore ad 1%. L'aplotipo esteso più
frequente risulta essere l'aplotipo A29;B44;DR7 con una
frequenza di 2,35% molto più alta della frequenza dello
stesso aplotipo in Italia (1,32%) o in Piemonte (1,36%),
mentre l'aplotipo A1;B8;DR3, il più frequente in Italia
(2,77%), risulta nel Cuneese al secondo posto con la
frequenza di 2,11%.
Discussione
Lo studio e la pubblicazione delle frequenze geniche ed
aplotipiche del Sistema HLA di popolazioni di individui
sani, come degli altri gruppi di marcatori genetici, è
indispensabile in alcuni settori, ad esempio per lo studio di
possibili associazioni tra HLA e malattie, per il calcolo
teorico della probabilità di trovare all'interno di una
particolare popolazione un donatore di midollo osseo
compatibile con un paziente, come supporto indispensabile
per l'attività forense nei casi di attribuzione di paternità e,
non ultimo, per lo studio delle popolazioni.
L'analisi delle frequenze geniche HLA della popolazione
cuneese, rapportata ad analoghi studi effettuati sulla
popolazione italiana10 e francese11, mette in evidenza alcune
caratteristiche di tale popolazione che la differenziano dalle
altre Regioni italiane e dal Piemonte stesso: la frequenza
genica dell'antigene HLA-A29 (5,5%) risulta essere la più
alta in Italia, dove la frequenza media risulta 3,5%, (in
Piemonte 4,0%); l'allele HLA-A30 invece risulta molto meno
frequente nella Provincia di Cuneo (2,87%), che non in Italia
(5,0%) o in Piemonte (4,4 %).
Per quanto riguarda il locus HLA-B, la frequenza
dell'allele B44 nel Cuneese (14,2%), è più alta di quelle
riscontrate nelle singole Regioni italiane10 (da 4,7% in
Sardegna a 10,4% in Piemonte).
Gli alleli HLA-B41 e -B49 sono invece meno frequenti
che in Italia e in Piemonte.
L'analisi di uno studio francese11 individua la frequenza
più elevata in Francia dell'antigene HLA-A29 in Aquitania
e nel Midi-Pyrenèes, cioè due regioni pirenaiche francesi,
così come in Aquitania si riscontra la frequenza più elevata
di HLA-B44.
I risultati del valore di eterozigosità dei singoli loci HLA
(tabelle II e III), mettono in evidenza i valori più bassi di
eterozigosità calcolati in Italia, se si esclude la Sardegna,
176
sia per il locus HLA-A che per il locus HLA-B, mentre per
il locus DR risulta il valore di eterozigosità più elevato;
quest'ultimo dato potrebbe essere dovuto al fatto che nello
studio italiano sono state considerate anche tipizzazioni
DR di donatori effettuate in seguito a selezione per
pazienti10.
Molto interessante, dal punto di vista dello studio della
popolazione cuneese, è l'analisi degli aplotipi estesi a 3 loci
(HLA A,B,DR), in rapporto agli analoghi studi effettuati in
Italia ed in Francia. Questo confronto è possibile in quanto
il metodo di calcolo degli aplotipi estesi applicato è lo
stesso7. Come risulta dalla tabella IV, l'aplotipo esteso più
frequente in provincia di Cuneo risulta essere
A29;B44;DR7 con frequenza di 2,35%, mentre in tutto il
Piemonte, quindi inclusi i donatori di midollo osseo cuneesi,
lo stesso aplotipo risulta solamente al quinto posto in
ordine di frequenza, con percentuale di 1,36%, simile a quella
italiana di 1,32%.
Questa anomalia ci ha indotti a confrontare la frequenza
dell'aplotipo esteso A29;B44;DR7 con le frequenze di altre
Regioni italiane10 ed estere8,11,12.
L'analisi di queste frequenze mette in evidenza come la
popolazione cuneese si differenzi, per questo aplotipo HLA,
dalle altre popolazioni italiane e si avvicini maggiormente
alle popolazioni pirenaiche francesi, come già indicato per
i singoli alleli HLA-A29 e HLA-B44, in particolare con la
popolazione del Midi-Pyrenèes e dell'Aquitania, uniche
regioni francesi, con il Limousin, in cui l'aplotipo esteso
A29;B44;DR7 è al primo posto come frequenza, con valori
che vanno da 2,5 % a 3,8%. Con la popolazione francese
quella cuneese condivide ben sette dei dieci aplotipi più
frequenti, mentre con la popolazione italiana gli aplotipi
condivisi sono sei (Tabella V).
Analizzando in dettaglio la distribuzione delle frequenze
dell'aplotipo A29;B44;DR7 nelle singole Regioni italiane10
e francesi7, risulta che questo aplotipo ha una frequenza
inferiore ad 1% nelle Regioni italiane del Centro-Sud, è
presente in Toscana, Emilia Romagna e nelle altre Regioni
del Nord, con frequenze che vanno da 1,3% a 1,7%, mentre
in Provincia di Cuneo e nella fascia delle Regioni Pirenaiche
è al di sopra di 2,3%, fino a raggiungere il massimo della
frequenza nella popolazione Basca, 6,7% (Figura 1).
In Francia questo aplotipo è il secondo in ordine di
frequenza (3,1%) dopo l'aplotipo A1;B8;DR3. Potrebbe
l'aplotipo A29;B44;DR7, che gli spagnoli12 hanno definito
come Western European, essere un aplotipo tipico delle
popolazioni della Linguadoca e Provenzali, cioè
dell'Occitania?
L'Occitania è, infatti, una regione ben definita che
comprende circa un terzo del territorio francese, delimitata
dal Mediterraneo, dai Pirenei, dall'Oceano Atlantico (Golfo
Frequenze HLA nel Cuneese
Figura 1: frequenze percentualli dell'aplotipo A29 B44 DR7in Italia, Francia e Paesi Baschi
Codici identificativi:
CN= Provincia di Cuneo, T= Toscana, E= Emilia-Romagna, V= Veneto, TN= Trentino-Alto Adige, LO= Lombardia, P= Piemonte, L=
Liguria, PRO= Provenza, LAN= Languedoc-Roussillon, MID= Midi-Pyrenèes, AQU= Aquitania, PB= Paesi Baschi
Tabella V: confronto tra i 10 aplotipi estesi più frequenti nella popolazione cuneese, italiana e francese
Aplotipi
cuneesi
A29
A1
A24
A2
A23
A2
A3
A11
A24
A2
B44
B8
B35
B51
B44
B44
B7
B35
B18
B44
DR7
DR3
DR11
DR11
DR7
DR4
DR2
DR1
DR11
DR7
Frequenza
Posizione
tra i primi 10
aplotipi italiani
Frequenza
italiana
Posizione
tra i primi 10
aplotipi francesi
Frequenza
francese
0,0235
0,0211
0,0153
0,0138
0,0125
0,0117
0,0115
0,0110
0,0106
0,0105
5°
1°
4°
3°
6°
7°
-
0,0132
0,0277
0,0143
0,0155
0,0111
0,0110
-
2°
1°
9°
6°
4°
3°
7°
0,0310
0,0500
0,0110
0,0130
0,0240
0,0300
0,0130
di Biscaglia), dal Massiccio Centrale francese e che
sconfina, sul versante italiano delle Alpi, in 12 valli delle
province di Cuneo, Torino, Imperia. Nelle valli del Cuneese
la cultura e la lingua occitana, una delle nove lingue
romanze, sono ancora radicate, così come sono ancora
frequenti i contatti con gli occitani francesi e dei Pirenei
spagnoli. Un'ulteriore conferma della maggior affinità
genetica della popolazione cuneese con quella francese
risulta dall'analisi del fenotipo esteso A2;B18;DR5, secondo
in ordine di frequenza in Italia, con frequenza 1,74% (1,57%
in Piemonte), ma che nella Provincia di Cuneo non risulta
tra i primi 12 aplotipi più frequenti con frequenza superiore
177
G Menardi et al.
ad 1%: la stessa cosa risulta sia nella popolazione francese
in generale, sia nelle singole Regioni francesi, se si esclude
Languedoc-Roussillon, dove è però presente solo al decimo
posto con frequenza di 1,2%.
Altri aplotipi estesi cuneesi, come A23;B44;DR7, sono
invece presenti tra gli aplotipi più frequenti francesi e non
nei primi 25 aplotipi più frequenti italiani10 (Tabella V).
In conclusione, lo studio effettuato conferma quanto
evidenziato dagli Autori nei precedenti studi sulle frequenze
geniche dei gruppi sanguigni2 e indica come la popolazione
del Cuneese appaia simile alle popolazioni pirenaiche
francesi e, più in generale, del Sud della Francia, terre in cui
fiorì la cultura occitana ed in cui ancora resistono,
soprattutto negli anziani, forme derivate dall'antica lingua
d'Oc. A parziale conferma di quanto sopra si veda la mappa
sintetica dell'Europa, pubblicata da Cavalli Sforza e Piazza13,
ottenuta dai valori della prima componente principale
calcolata dalle frequenze di 95 geni, in cui gli Autori
individuano un'area iberico-occitana di variabilità comune
a molti geni che ricalca in buona parte l'area da noi descritta.
Riassunto
Lo studio delle frequenze alleliche ed aplotipiche del
sistema HLA, oltre ad essere indispensabile per la ricerca
di donatori di midollo osseo e in medicina legale, rende
possibile identificare gruppi etnici diversi e stabilire le
relazioni tra di loro. In questo studio sono presentate le
frequenze del sistema HLA-A,-B,-C e HLA-DR,-DQ in una
popolazione di donatori della Provincia di Cuneo. Le
frequenze sono state confrontate con quelle di altre
Regioni italiane e francesi e i risultati indicano come la
popolazione cuneese sia maggiormente correlata con le
popolazioni occitano-pirenaiche della Francia piuttosto
che non con le popolazioni delle altre Regioni italiane.
178
Bibliografia
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