lezione9-real time

Quantitative Real-time PCR
Tecnica che consente la simultanea amplificazione e
quantificazione del DNA target
AMPLIFICAZIONE:
prevede essenzialmente gli
step di una classica PCR
effettuata aggiungendo
composti la cui fluorescenza
QUANTIFICAZIONE: emessa ad ogni ciclo di reazione
è proporzionale alla quantità di
amplificato
Real-Time PCR: la reazione
COMPONENTI DELLA REAZIONE:
1) DNA target
2) DNA polimerasi
3) Due oligonucleotidi
4) dNTPs
5) Fluorocromo
APPLICAZIONI
Diagnosi malattie infettive
Quantificazione patogeno
RICERCA
Espressione genica
OGM
Perché Real-Time?
Misura l amplificazione in
tempo reale nella fase
esponenziale
Target copy number
Curva di amplificazione PCR
Exponential
phase
Pateau phase
cycle number
RT-PCR quantitativa
La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazione
viene rilevata e analizzata tramite computer
Incremento di
fluorescenza
Plot lineare
Cicli di PCR
Plot di amplificazione
Fluorescenza
Curve di amplificazione
Cicli di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione
il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente
proporzionale alla quantità di templato iniziale
Curva di amplificazione PCR
96 replicati di uno stesso
campione danno quantità finali di c-DNA
molto diverse
Differenze quantificazione
PCR convenzionale/Real-time PCR
PCR conv.
Real-time PCR
♦  End-point
♦  Fase esponenziale
♦  No monitoraggio
♦  Monitoraggio
♦  < Sensibilità
♦  > Sensibilità
♦  Post-PCR
♦  No post-PCR
Strumentazione Real-time
♦  Termociclizzatore
♦  Sorgente laser
♦  Detector
Strumentazione Real-time
Strumentazione Real-time
Q
F
5’
3’
Tubulin
Q
H
5’
3’
GapdH
Q
TX
5’
3’
β-actin
Q
Cy5
5’
3’
Cyclophilin
ANALISI REAL-TIME PCR
Dopo ogni rilevamento, i segnali di
fluorescenza sono processati da un
software e la cinetica di formazione
dell amplificato è visualizzata
graficamente come incremento dei
segnali di fluorescenza in ordinata (ΔRn)
per cicli di reazione in ascissa
ΔRn = Rn + - Rn -
Rn + = int. fluor. R/int. fluor. Q al mom. rilev.
Rn - = int. fluor. R/int. fluor. Q prima dell amplif.
CICLO THRESHOLD
Il ciclo threshold (CT) è il ciclo della reazione di
amplificatione nel quale il segnale di fluorescenza
supera il valore di threshold
Il threshold rappresenta quel valore di fluorescenza
pari a 10 volte la ds della fluorescenza registrata nei
primi cicli di amplificazione (background)
2
T h re s h o l d
B a se lin e
Sa m p le
1 .6
1 .2
0 .8
0 .4
CT
0
0
10
20
21
30
40
CICLO THRESHOLD
Il Ct di 96 replicati dello stesso campione
mostra valori di fluorescenza quasi identici
perché è calcolato in fase esponenziale
CICLO THRESHOLD
È strettamente correlato al numero di copie iniziali del target
  Un numero iniziale di copie pari al doppio anticipa il Ct di un ciclo
  Un numero iniziale di copie pari a metà posticipa il Ct di un ciclo
  Due campioni che possiedono q di target diverse di 1 log hanno un
DCt di 3,3
 
Si mantiene lineare con log di numero di copie iniziali che superano i 6-8
ordini di grandezza
Which one
The least?
has the
most?
QUANTIFICAZIONE
ASSOLUTA:
i campioni sono quantificati in modo assoluto
  Necessita di standard di cui si conosce la
concentrazione assoluta (utilizzo di una curva
standard)
  Per tutti gli unknowns devono essere saggiate
identiche quantità di campioni
RELATIVA: la quantificazione viene effettuata paragonando i Ct
 Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una
curva standard)
 Gli unknowns vengono quantificati paragonando il
loro ΔCT con quello del controllo endogeno
QUANTITATIVA ASSOLUTA
Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello
di un gene espresso costitutivamente (b-actina, GAPDH,
ATPs, b2 etc)
CICLO THRESHOLD
Il Ct è un indicatore del numero di
copie iniziali
CURVA STANDARD
Amplificando in parallelo ai campioni a conc. non nota
(unknown) degli standard esterni (a conc. nota) a
diverse diluizioni, è possibile costruire una retta di
regressione (curva di taratura o curva standard)
Conoscendo il valore di Ct, la conc. degli UKN si può
ricavare per interpolazione ponendo il Ct in ordinata
e la conc. iniziale in ascissa
CURVA STANDARD
CURVA STANDARD
Il sistema consente di valutare l efficienza di
amplificazione mediante l analisi di tre parametri:
1.Slope (s):
indica il n° di cicli che intercorrono tra due diluizioni
dello standard che differiscono di 1 log (teorico -3,3)
esprime le correlazioni esistenti tra i
2.Coeff. correlazione (R): diversi segmenti che compongono la
retta di regressione (teorico 1)
3. Intercetta nell asse (y):
definisce il n° di cicli necessari per
rilevare 1 copia di DNA target
STANDARD
Virus:
ac. nucleico estratto da diluizioni log di sosp. virale
titolata su cellule (TCID50/50ml, PFU)
Per DNA:
Per RNA:
plasmide contenente il target, la cui conc. è stata
determinata allo spettrofotometro (ng/ml) ed
eventualmente trasformata in numero di copie
plasmide trascritto in vitro; la conc. di RNA
standard è determinata allo SF (ng/ml) ed
eventualmente trasformata in numero di copie
QUANTITATIVA RELATIVA
ΔCT
Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il
cambiamento di espressione di un gene target in un campione
rispetto ad un altro campione scelto come calibratore
QUANTITATIVA RELATIVA
Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario:
• TARGET – La sequenza di DNA da analizzare.
• CALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento
per l analisi comparativa
• CONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso
costitutivamente in tutti i campioni analizzati necessario
per normalizzare i dati rispetto alla quantità di DNA
caricato e a variazioni di efficienza della reazione
Quantitativa relativa: analisi dei dati
 Normalizzare il target con un controllo endogeno (r)
espresso costitutivamente (ΔCT)
 Comparare ciascun ΔCT così ottenuto con il ΔCT di un
calibratore (cb) (ΔΔCT)
2 -(ΔCT,r- ΔCT,cb) = 2 –ΔΔCT
 Il valore così ottenuto permette di determinare la
Concentrazione relativa del target
Step per il calcolo del 2- DDCT
1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)
Ct gene interesse – Ct HK = ΔCt
2. Normalizzazione con il calibratore
ΔCt Campione – ΔCt Calibratore = ΔΔCt
3. Applicare la formula
2
-ΔΔCt
ESEMPIO
Di quanto varia l espressione dell IL-10 tra Liver e Brain?
1. ΔCt Brain = 18
ΔCt Liver = 12
2. ΔCt campione – ΔCt calibratore = 12-18 = -6
3. 2 -ΔΔCT = 26 = 64
L IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!
Chimiche Real-time PCR
Tutte le chimiche fanno uso di fluorocromi che emettono
fluorescenza se eccitati da una luce a determinata λ
Coloranti intercalanti
"   SYBR green
"   Etido bromuro
Sonde specifiche ad ibridizzazione
"   TaqMan (sonde di ibridazione con idrolisi)
"   FRET
"   Molecular beacons
(sonde di ibridazione senza idrolisi)
"   Scorpion (sonde incorporate nei primers)
COLORANTI INTERCALANTI
EtBr
SYBR Green
emette fluorescenza 25 volte più
intensa se legato a dsDNA
emette fluorescenza 200
volte più intensa se legato a
dsDNA
SYBR GREEN: principio
Utilizza una molecola
fluorescente non specifica che si
lega al solco minore del DNA
SYBR GREEN
  L’intercalante
emette una bassa fluorescenza
quando non è legato a dsDNA
  Durante
l’estensione SYBR Green si lega a
dsDNA: il segnale aumenta
  Durante
la denaturazione SYBR Green torna
in soluzione: il segnale dimunisce
SYBR Green
E un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed
emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.
DENATURAZIONE
Non viene rilevata fluorescenza
SYBR Green
Primer
ANNEALING
L intensità della fluorescenza
comincia ad aumentare
Luce emessa
ALLUNGAMENTO
L intensità della fluorescenza continua
ad aumentare e diventa massima al
termine della fase di allungamento
Polimerasi
L AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E
REGISTRATO A 530nm
SYBR GREEN
5’
3’
5’
3’
5’
3’
d.NTPs
Primers
Intercalation Dyes
Thermal Stable
DNA Polymerase
Add Master Mix
and Sample
Reaction Tube
3’
Taq
λ
5’
Denaturation
ID
3’
5’
Annealing
SYBR GREEN
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Extension
3’
5’
ID
Taq
ID
5’
ID
Taq
ID
3’
5’
ID
Taq
λ
3’
λ
ID
ID
5’
ID
λ
λ
5’
Taq 5’
ID
ID
λ
Repeat
5’
3’
Extension Continued
Apply Excitation
Wavelength
SVANTAGGI
♦  Specificità è data solo dai primers
♦ La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie
eliche, includendo i dimeri di primers
♦ È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici
VANTAGGI
  Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa
  Non costosa
Curva di melting alla fine della reazione
  Misurazione
della fluorescenza durante il
progressivo aumento T > Tm target
  Alla T alla quale i filamenti di DNA si
separano, il segnale precipita
Il modo più semplice di programmare una curva di
melting consiste nell aumentare gradatamente la
temperatura (0.5°C per ciclo)
SYBR GREEN
Due modi per analizzare la curva di melting
 
 
la diminuzione della fluorescenza
con l’aumentare della temperatura
il tasso di dimuzione della fluorescenza
nel tempo
SYBR GREEN
 
Diminuzione della fluorescenza
con l’aumentare della temperatura
SYBR GREEN
 
Tasso di dimuzione della fluorescenza
nel tempo
specifico
aspecific
o
SONDE DI IBRIDAZIONE
•  Sonde di ibridazione con idrolisi
–  TaqMan
•  Sonde di ibridazione senza idrolisi
–  Molecular Beacons
–  Dual oligo FRET probes
•  Sonde incorporate nei primers
–  Amplifluor
–  Scorpions
TAQMAN PROBES
Il sistema TaqMan è costituito da 2 primers + 1
sonda (probe)
Sfrutta l attività 5 -3 esonucleasica di alcune
polimerasi (Taq, Tth, Tfl)
Il probe è costituito da un oligonucleotide marcato con
fluorocromi alle estremità 5 e 3 •  Fluorocromo 5
REPORTER
•  Fluorocromo 3 QUENCHER
Quando la sonda non è ibridata, Q assorbe la
fluorescenza di R ed il sistema è silente TAQMAN PROBES
Principio di Forster del trasferimento dell energia
R
Q
Q
R
TAQMAN PROBES
5’
3’
5’
3’
5’
3’
d.NTPs
Primers
Add Master Mix
and Sample
Thermal Stable
DNA Polymerase
R
Probe
5’
Q
3’
Reaction Tube
3’
5’
Taq
Denaturation
3’
λ
5’
R
5’
Annealing
Q
3’
TAQMAN PROBES
Q
R
5’
3’
3’
5’
5’
3’
Extension Step
R
Q
R
Taq
3’
1. Strand Displacement
5’
5’
3’
R
Q
3’
Taq
2. Cleavage
5’
5’
3’
R
Taq
3. Polymerization
Complete
5’
3’
5’
3’
λ
R
Taq
3’
5’
5’
3’
4. Detection
TAQMAN PROBES
Vantaggi
•  Il sistema TaqMan produce un robusto
segnale cumulativo
•  Chimica più utilizzata in real-time
•  Mix precostituite per molti saggi TaqMan
Svantaggi
•  Il quencher emette fluorescenza
•  Elevato background
•  Specificità alta, ma inferiore rispetto a
beacon
TAQMAN PROBES
Disegno di primers e probe
º  Amplicone di 70-150 bp (+ facile
denaturazione)
º  Tm probe = 68-70°C (10°C > Tm primers)
º  Tm primers =
58-60 °C
º  No G all’estremità 5’ del probe
TAQMAN PROBES
Effetto della lunghezza dell’amplicone
sull’efficienza di reazione
Stessa sonda, stesso DNA-target, stessa [ ] di DNA
TC = 19.4
TC = 20.9
Primers studiati per RealTime PCR:
I primers amplificano un segmento di 79 basi del transgene TSWV-N
Primers utilizzati in PCR tradizionale:
I primers amplificano un segmento di 273 basi del transgene TSWV-N
File termico
•  Poiché l’idrolisi della sonda avviene solo se
questa è ibridata al target, l’estensione
dovrebbe avvenire a T compatibili con la Tm
della sonda
•  Molti sistemi TaqMan utilizzano due soli
step:
1. denaturazione a 94°C
2. annealing/extension a 60°C
SONDE MINOR GROOVE BINDER
(MGB)
•  Aumento della stabilita termodinamica
•  Riduzione della lunghezza della sonda
(12-18 basi)
•  Incremento della specificita
snps
diidrociclopirroloindolocarbossilato tripeptide, CDPI3
PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2)
VARIAZIONE NEL GENE DELLA
PROTEINA DEL CAPSIDE
PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2)
DISEGNO DI PRIMERS E SONDE MGB
Test 2a/2b
Test 2b/2c
CPVa/b-For
CPVb/c For
CPVa/b-Rev
CPVb/c Rev
CPVa-Pb (marcata con VIC)
(marcata con FAM)
CPVb1-Pb (marcata con FAM)
(marcata con VIC)
4062A
G
CPVb2-Pb
CPVc-Pb
4064T
A
MOLECULAR BEACONS
•  Possiedono una struttura stem and loop
• Il loop è costituito da una regione complementare alla
sequenza target
• Lo stem è costituito da due braccia complementari tra
di loro, marcate rispettivamente con reporter e
quencher
MOLECULAR BEACONS
Lungh. braccia = 4-7 bp
Tm loop = 68-70°C
Tm braccia =2-5°C<Tm loop
Tm primers=58-60°C
MOLECULAR BEACONS
• In soluzione il beacon assume una forma a
forcina (hairpin), a causa della elevata
complementarietà tra le basi delle braccia
QUENCING
• Quando è ibridato al target, il beacon assume
conformazione lineare
FLUORESCENZA
MOLECULAR BEACONS
5’
3’
5’
3’
5’
3’
d.NTPs
Primers
Thermal Stable
DNA Polymerase
Molecular
Beacon
R
Reaction Tube
Add Master Mix
and Sample
Q
3’
5’
Taq
Denaturation
3’
R
5’
5’
Annealing
Q
3’
MOLECULAR BEACONS
λ
Q
R
5’
3’
3’
5’
5’
3’
Q
3’
Detection
Extension Step
R
5’
Taq
5’
5’
3’
1. Strand Displacement
Molecular
Beacon
2. Polymerization
Complete
Probe Silent
Taq
R Q
3’
5’
5’
3’
MOLECULAR BEACONS
Vantaggi
•  Alta specificità (1 nt)
•  Basso background
Svantaggi
•  I beacon non producono un robusto
segnale cumulativo
•  Difficoltà nel disegno del beacon
FRET PROBES
• Utilizzano due sonde diverse che ibridizzano al
target in modo che l estremità 5 della prima sia
vicina alla estremità 3 della seconda (ibridazione
testa-coda)
• La prima sonda reca alla estremità 5 un fluoroforo
(donatore) la cui emissione è silente, ma capace di
eccitare il fluoroforo presente alla estremità 3
dell altra sonda
• Solo l emissione del secondo fluoroforo è captata
dal detector
Sonde FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer)
Simili alle sonde TaqMan perché si legano al
DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono
però due sonde ognuna marcata con un solo
fluorocromo (accettore e donatore)
Quando le sonde non sono legate alle sequenze
target il segnale fluorescente proveniente
dall'accettore non è rilevato
Durante lo step di annealing PCR, entrambe le
sonde FRET ibridizzano alle sequenze target:
ciò avvicina il fluoroforo donatore
all'accettore permettendo il trasferimento di
energia tra i due fluorofori e la produzione di
un segnale fluorescente da parte
dell'accettore che viene rilevato
donatore
accettore
FRET PROBES
l
R
D
5’
3’
5’
5’
3’
3’
1-5 bases
D
3’
5’
Extension Step
R
Taq
Detection
5’
5’
3’
1. Strand Displacement
System Silent
R
2. Polymerization
Complete
System Silent
Taq
3’
5’
5’
3’