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Consulente tecnico e prova scientifica Carlo Robino Laboratorio di Scienze Criminalistiche Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale Università di Torino Tutto quello che avreste voluto sapere dal test del DNA* * Ma non dovreste osare chiedere 9 il test del DNA è un esame comparativo • identificazione individuale • consanguineità Che si mangia, pà? Cicogna Identificazione individuale 9 tutte le cellule di un individuo recano il medesimo patrimonio genetico (DNA nucleare, DNA mitocondriale citoplasmatico) 9 il 99,9% della sequenza di DNA è identica in tutti gli esseri umani 9 nel restante 0,1% sono possibili delle differenze inter-individuali (polimorfismi) 9 lo studio di un numero cospicuo di polimorfismi (13-15 per i marcatori “STR” correntemente in uso in ambito forense) consente di ricostruire combinazioni di varianti che identificano in maniera pressoché esclusiva il singolo soggetto (frequenza del profilo genetico 1 X 10-17, un individuo ogni cento milioni di miliardi) 9 lo sviluppo delle tecniche consente di ricostruire profili genetici identificativi anche a partire da tracce minuscole (<100 picogrammi di DNA, pari a 16 cellule nucleate) 9 apparenti incompatibilità genotipiche campioni biologici di un medesimo individuo tra diversi 1) Artefatti di PCR 9 Il DNA che andiamo ad identificare e comparare non è quello originario contenuto nella traccia, ma un insieme di milioni di sue copie ottenute artificialmente mediante una tecnica detta polymerase chain reaction (PCR) 9 la PCR può generare degli artefatti! Low copy number DNA (LCN DNA) – Low template DNA (LT DNA) 9 Gill P et al (Forensic Sci Int 2001): < 100 pg di DNA iniziali nella reazione di PCR 9 Caddy et al (2008 Report to the UK Home Office a seguito del caso Hoey): < 200 pg di DNA iniziali nella reazione di PCR 9 Gill P e Buckleton J (Forensic Sci In Genet 2009): impossibile definire LT DNA; in generale, è possibile riferirsi a condizioni nelle quali la quantità assoluta o le caratteristiche molecolari del DNA introdotto nella PCR (degradazione) rendono altamente verosimile la comparsa di effetti stocastici della reazione di PCR LCN DNA – LT DNA Comparsa di alleli sovrannumerari (allelic drop-in) Perdita di un allele (allelic drop-out) drop-out Sbilanciamento allelico 9 > cicli di PCR (da 28 a 34) • replica dei dati • ogni genotipo omozigote potenzialmente eterozigote (modelli matematici) 9 il Forensic Science Service britannico, che ha introdotto le tecniche LCN-DNA e le ha applicate ad oggi in oltre 21.000 casi, si rifiuta di rivelare nel dettaglio le procedure analitiche 9 FBI nel 2001 ha raccomandato di farne uso solo in casi particolari (identificazione di resti scheletrici di persone scomparse) 9 A seguito del caso Hoey l’uso di LCNDNA è stato sospeso dal 2007. Uno studio condotto da un comitato d’esperti per conto del Ministero degli Interni britannico ha tuttavia ritenuto la metodica “robusta” e “adatta allo scopo” e dunque essa è stata reintrodotta dal 2009 Nature 2010 9 Negli Stati Uniti sono state pronunciate numerose sentenze discordanti riguardo all’ammissibilità in processo di LCN-DNA quale prova scientifica, mancando un accordo nella comunità scientifica riguardo a procedure e interpretazione statistica DNA degradato 9 gli agenti ambientali (umidità, temperatura, radiazioni solari, nucleasi batteriche e fungine) frammentano progressivamente i filamenti di DNA contenuti nelle tracce 9 a fronte di una quantità di DNA anche cospicua nella traccia, le regioni polimorfiche ancora integre suscettibili di amplificazione mediante PCR possono essere poche: condizioni analoghe a LCNDNA/LT-DNA 2) Discrepanze tra diversi kit di PCR (primer binding site mutations) Heterozygous alleles are well balanced 6 8 8 * Allele 6 amplicon has “dropped out” 9 in un campione di popolazione filippina (n=140) tredici incosistenze per il locus D8S1179 tra PP16 (genotipi eterozigoti) e ProfilerPlus (genotippi omozigoti): mutazione nel binding site di ProfilerPlus con dropout allelico 9 inclusione di un secondo reverse primer per D8S1179 in Identifiler Leibelt et al Forensic Sci Int 2003 3) Fenomeni biologici che mettono in crisi l’assioma secondo il quale tutte le cellule di un individuo hanno il medesimo DNA • instabilità di microsatelliti (MSI) e perdita di eterozigosità (LOH) in tessuti neoplastici ≈ drop out ≈ drop in 9 campione presunto padre: biopsia inclusa in paraffina (1992) con dx istologica di “adenocarcinoma del colon…” STR TH01 TPOX FES/FPS CSF1PO D8S1179 D13S317 Presunto padre 6-8 11-11 11-11 10-11 12-17 11-12 Figlio 6-8 8-11 10-11 11-12 13-17 11-11 Madre 8-9.3 9-11 10-11 12-12 13-13 11-11 9 LOH? 9 mutazione germinale? 9 CTU esclude TPOX dal calcolo della probabilità di paternità (PP) e conclude per “forte indicazione di sussistenza della paternità biologica (PP=99.52%)” 9 se si esclude TPOX perché “non affidabile”, perché non escludere anche gli altri STR (possibili false compatibilità dovute a MSI)? 9 PP includendo nei calcoli TPOX si riduce a 1.7%! 9 alcuni soggetti presentano diverse popolazioni di DNA mitocondriali, con diverese distribuzioni nei singoli tessuti 9 il fenomeno è particolarmente evidente in tessuti composti da poche cellule con un’origine pressoché clonale (cellule del follicolo pilifero) 9è possibile osservare in singoli peli aplotipi mitocondriali diversi da quello di un campione di riferimento del medesimo individuo (sangue, saliva) per mutazioni avvenute nel follicolo o per segregazione nel pelo di una sola variante eteroplasmica 9 la frequenza relativa di due sequenze eteroplasmiche varia all’interno del fusto di uno stesso pelo • eteroplasmia mtDNA Tully et al. Forensic Sci Int 2004 4) Discrepanze di nomenclatura “dicano i consulenti, previo esame della documentazione in atti e acquisita eventualmente ogni altra documentazione presso enti pubblici e privati, se il DNA estratto dai reperti e analizzato nell’ambito del procedimento avente ad oggetto l’omicidio commesso nei confronti di xxx, risulti o meno compatibile con il profilo genetico dell’indagato yyy” Caso A Caso B STR SGM plus Powerplex 16 D3S1358 15;15 15;15 TH01 6;9 6;9 D21S11 59;61* 27;28** D18S51 14;20 Amel X;Y X;Y vWA 17;17 17;17 D8S1179 12;15 12;15 * Urquhart et al Int FGA 20;24 J Legal Med 1994 D16S539 11;12 11;12 D19S433 13;15 ** Moller et al Int J Legal Med 1994 D2S1338 - 9 apparenti identità genotipiche tra individui diversi 1) DNA degradato 9 amplificazione esclusiva di polimorfismi di minore lunghezza 9 riduzione del numero di marcatori che compongono il profilo genetico, con conseguente aumento del rischio di match, in special modo se un profilo parziale ignoto viene confrontato con quelli archiviati in vasti database 9riduzione del numero di marcatori che compongono il profilo genetico, con conseguente aumento del rischio di match, in special modo se un profilo parziale ignoto viene confrontato con quelli archiviati in vasti database Lancet, 2003 2) Ricerca entro database 9 i singoli database nazionali di profili di DNA presentano un numero limitato di marcatori in comune 7 marcatori condivisi (il trattato di Pruem, ne prevede almeno 6, per lo scambio dei dati) UK 9 Per 6 STR, la chance di condivisione casuale del genotipo è di circa 1 ogni 5 milioni Enfsi Germania 9 al giugno del 2009 i database europei contengono i DNA di oltre 7 milioni di persone 9 per ogni nuova traccia sconosciuta archiviata, ci attendiamo, pertanto, di trovare almeno un soggetto compatibile per ragioni meramente casuali! 3) Contaminazione del materiale usato per repertamento o indagini di laboratorio 9 la storia del “fantasma di Hellbronn” http://news.bbc.co.uk/2/hi/europe/7966641.stm 4) Marcatori aploidi del DNA (cromosoma Y, DNA mitocondriale) 9 Contenuti in singola copia nel patrimonio genetico dell’individuo (gli altri cromosomi sono presenti in due copie, l’una ereditata dal padre l’altra dalla madre) 9 Trasmessi in forma invariata dal padre a tutti i figli maschi (Y) e dalla madre a tutti i figli (DNA mitocondriale, mtDNA) 9 Tutti i soggetti maschi con un comune antenato paterno recente condividono il medesimo cromosoma Y e non sono quindi distinguibili sulla base di esso 9 Tutti i soggetti con un comune antenato materno recente condividono il medesimo mtDNA e non sono quindi distinguibili sulla base di esso 9 Inoltre, per ragioni evolutive, vi è un elevata percentuale di soggetti non imparentati con cromosoma Y o mtDNA identici (il 7% degli Europei, ad esempio, ha lo stesso mtDNA!) → Basso potere identificativo 9 circostanze che rendono difficoltoso affermare o escludere con fondata certezza che il DNA di un deteminato soggetto sia presente nel profilo ottenuto dalla traccia • LCN-DNA / LT-DNA • DNA degradato • DNA misto Non solo i criminali depositano il proprio DNA! Le tracce repertate spesso contengono anche quello della vittima, o di altri soggetti che erano venuti a contatto con il reperto in maniera innocente in tempi precedenti al delitto La società scientifica internazionale dei genetisti forensi (ISFG) ha recentemente prodotto delle linee guida per l’interpretazione di tracce miste, tuttavia rimane grande disaccordo sia riguardo a 9 modelli matematici di interpretazione dei dati • definizione del numero di contributori • utilizzo delle aree dei picchi elettroforetici 9 modalità di definizione dei profili • trattamento degli “stutter” • definizione di una soglia minima elettroforetici di inclusione dei picchi In generale, l’interpretazione di un profilo misto è relativamente semplice quando la proporzione tra DNA di due contributori è più o meno paritaria. Per rapporti relativi oltre 1:5, l’identificazione corretta del profilo minoritario è molto difficile; per rapporti oltre 1:10 gli alleli del cotributore minoritario diventano di fatto invisibili Stutter Deletion caused by slippage on the copied (bottom) strand True allele (tetranucleotide repeat) 1 2 3 5’ GATA GATA GATA GATA 3’ CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT 1 2 3 5 6 5 C T A T 4 n-4 Typically 5-15% of true stutter allele in tetranucleotide product repeats STR loci stutter? stutter? stutter? stutter? stutter? Schneider et al. Forensic Sci Int 2004 Quale soglia minima per includere un picco nell’analisi? 9 in uno studio interlaboratorio (Duewer et al. J Forensic Sci 2001) solo il 69% dei laboratori estrapola correttamente il profilo maschile in una traccia M/F 3:1 (con genotipi femminili noti) 9 la percentuale di successo scende al 10% nell’estrapolazione di un profilo maschile ignoto da una traccia contenente tre diversi DNA, F/M1/M2 2:1:1 (profilo femminile e M1 noto) “If you show 10 colleagues a mixture, you will probably end up with 10 different answers” (Peter Gill) Che altro il test del DNA ci può dire “a priori”? Il sesso dell’individuo che ha depositato la traccia biologica F Gene dell’ M Amelogenina 9 Possibili mutazioni nel primer binding site 9 In alcune popolazioni percentuale relativamente alta di soggetti di sesso maschile il cui cromosoma Y presenta delezioni in corrispondenza del locus dell’Amelogenina: • nepalesi 6.5% (Cadenas et al Forensic Sci (M) (M) M F F Int 2007) • indiani 3.6%; malesi 0.9% et al J Forensic Sci 2003) (Chang M Scorretta identificazione del genere del soggetto che ha lasciato la traccia! Per ora, di serio, nient’altro…almeno utilizzando marcatori STR convenzionali 9 l’origine etnica del soggetto che ha depositato la traccia Probabilità d’assegnare un profilo genetico alla corretta popolazione, in base alla variabilità interetnica di STR autosomici Lowe et al Forensic Sci Int 2001 “Vista la particolarità del profilo genetico maschile, deducibile dalle basse frequenze di apparizione di taluni genotipi rispetto al nostro campione della popolazione italiana (profilo 1000-10000 volte più raro come frequenza di apparizione), si può arguire che il suddetto profilo non appartenga ad un soggetto caucasico” Il serial killer era genovese … nel frattempo fece altre due vittime Una più precisa assegnazione etnica è possibile mediante marcatori a più lento tasso di mutazione (SNP) di cr. Y, mtDNA o autosomi Y-SNP Africa aut-SNP Europa mtDNA Joblin et al Nature Rev Genet 2003 Asia orientale www.mitomap.org Phillips at al FSI Genetics 2007 Genotipo Vs. Fenotipo Il 20% della popolazione algerina urbana (Orano) possiede un cromosoma Y europeo o subsahariano (Robino et al Int J Legal Med 2008) Il 45% della popolazione urbana di Buenos Aires possiede un aplogruppo mitocondriale tipicamente amerindio (Martinez et al Hum Biol 2004) 9 Caratteri antropometrici a determinazione genetica semplice capelli rossi 9 8 SNP di MC1R (il gene regolatore della sintesi della melanina) responsabili del colore rosso dei capelli 9 100% dei soggetti omozigoti per un SNP hanno capelli rossi 9 94% dei soggetti eterozigoti per due SNP hanno capelli rossi 9 12% dei soggetti eterozigoti per un SNP hanno i capelli rossi Grimes et al. Forensic Sci Int 2001 9 studi di associazione genome wide e individuazione di geni candidati per: • colore degli occhi (90% di corretta identificazione di occhi azzurri/marroni; Walsh et al FSI Genet 2010) • colore della pelle, peso, altezza, … 9 Epoca di deposizione di una traccia “…dicano i periti, esaminati gli atti e compiuto ogni accertamento che sarà ritenuto opportuno, l’arco temporale entro il quale tracce biologiche aventi le caratteristiche riscontrate sui fazzolettini in sequestro possano permanere all’aria aperta ed all’esposizione degli agenti atmosferici e, comunque, nel luogo in cui furono rinvenuti i reperti stessi…” 9 la qualità di un profilo genetico dipende dal grado di integrità delle molecole di DNA estraibili da una traccia; la degradazione del DNA non è però un fenomeno correlato al tempo, bensì alle condizioni ambientali di conservazione del reperto (temperatura, umidità, azione di microorganismi, etc…) mozzicone di sigaretta fumato 5 anni prima dell’analisi mozzicone di sigaretta fumato 1 giorno prima dell’analisi A meno che… Indagato Indagato vittima vittima #3 Indagato #3 #5 Vittima Vittima #5 #7 #6 #3 #5 Vittima Vittima #5 9 Modo di deposizione di una traccia per contatto (Lowe et al Forensic Sci Int 2002) Tendenza a depositare il proprio DNA • buoni depositatori (“BD”) • cattivi depositatori (“CD”) • Phipps et al (FSI 2006): impossibile distinguere BD e CD (differenze nell’ estrazione di DNA? nell’allestimento dell’esperimento?) 9 Tempo di persistenza di una traccia depositata per contatto Macchia secca allestita con globuli bianchi su vetrino, conservata al chiuso e a t ambiente Raymond et al FSI Genet 2009 Macchia secca allestita con globuli bianchi su borsa di plastica, conservata all’aperto e protetta da sole e pioggia Macchia secca allestita con globuli bianchi su superficie esterna di una casa, esposta a sole e pioggia 9 Trasferimento secondario mediante contatto DNA dell’individuo A (“BD”) Individuo B (“CD”) Oggetto (Lowe et al Forensic Sci Int 2002) 9 Trasferibilità di tracce (Goray et al, FSI Genet 2009) Trasferimento di sangue secco tra due superfici non assorbenti (plastica) • per semplice contatto (60 sec): 1,45% • per contatto (60 sec) e pressione (1 kg): 0,25% • per sfregamento (60 sec): 44,5% “Friction contact increased the transfer of dry biological materials relative to passive and pressured contact with the greatest transfer evident for samples deposited on plastic. This could in part be explained by the fact that a dry sample becomes more powdery after friction, and could thus be more easily dislodged from a non-porous substrate. Additionally, any of the powder transferred could then also be easily lost from thesecondary substrate.” • meno di 10 passi che hanno intercettato tracce di sangue secco con area inferiore a 64 mm2 • scarpe sequestrate a 20 h dai fatti, nel corso delle quali l’imputato ne ha fatto comune uso “L’imputato non poteva non sporcarsi le scarpe di sangue” ?! 9 Tempi relativi di deposizione delle componenti di una traccia A e B? A e poi B? A B e poi A? B 9 Attribuzione individuale delle componenti di una traccia A e B? A e B? A B Natura della traccia biologica 9 metodi chimico-enzimatici: • di semplice esecuzione • molto sensibili • poco specifici 9 Violenza sessuale su minore • slip con tracce positive al test per α amilasi • profilo genetico misto vittima (F) / indagato (M) • saliva? • urina e sudore? • saliva di F o di M? Aree picchi M/F Attività α amilasi Barni et al J Forensic Sci 2006 “…il sangue rinvenuto nel letto…è risultato frammisto a saliva e relativo alla vittima” sulla base di positività a test enzimatico per amilasi tampone vaginale della vittima prelevato in corso di autopsia “In addition, the presence of bacterial amylase in and on the human body, for example in the vaginal cavity (as well as amylase from vaginal secretion) can lead to measurable amylase activity on swabs taken from sexual assault victims” Quarino et al J Forensic Sci 2005 9 Metodi immunologici • Ab anti HB, PSA, α-amilasi • Specie-specifici (primati) • Falsi positivi (altri liquidi biologici umani) • Falsi negativi (high dose hook effect) • Meno sensibili • Positivi su macchie secche di antica data • Possibili negativi: trattamento con detergenti ionici, candeggina 9 Metodi biomolecolari (RT-PCR con sonde per mRNA tessuto-specifici) • callicreina 3 specifico per liquido seminale (Nussbaumer et al Forensic Sci Int 2006) • oltre 54.000 mRNA saggiati (Zubakov et al Int J Legal Med 2007) • 5 geni saliva-specifici e 9 geni sangue-specifici Idem con miRNA! Zubakov et al Int J Legal Med 2010 • risultati positivi in tracce fino a 180 gg • impossibile identificare mRNA specifici per saliva vs. secrezioni vaginali Sperma Espressione nel Tessuto target Espressione nel Tessuto non-target Secrezioni vaginali Molto spesso non è possibile stabilire con certezza la natura del materiale cellulare dal quale si estrae il DNA, in particolar modo quando si effettuano campionature casuali da indumenti o dalla superficie di oggetti (si può ipotizzare che si tratti in genere di cellule epidermiche di sfaldamento) “dica il C.T.…se gli indumenti siano utilmente indagabili al fine di reperire tracce biologiche segnatamente di urina- e, in caso positivo, se le stesse siano riferibili a … o ad altri soggetti” non ci sono test certi per la diagnosi di natura di urina (PSA ?, urobilinogeni ?) la traccia “gialla” è della vittima? Profilo della vittima Tracce di urina secca non sono certamente campioni ideali da cui estrarre DNA! 9 Omicidio: indagato un convivente della vittima • su un indumento rinvenuto nell’abitazione “sottoposto ad un più approfondito esame … e successiva analisi al microscopio binoculare … traccia verosimilmente ematica” • “… effettuato test con benzidina … confermandone la natura ematica” • “gli accertamenti … consentono di affermare che la traccia evidenziata sull’indumento corrisponde ad una commistione tra indagato e vittima, che contiene sangue umano riconducibile alla vittima”