PROBLEMI DI ALTERAZIONE MICROBIOLOGICA

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PROBLEMI
DI
ALTERAZIONE
MICROBIOLOGICA:
BIOFILM
E
BIOFULING (FENOMENO, CAUSE, EFFETTI).
Convegno “Influenza dei sistemi di distribuzione sulla qualità dell’acqua potabile” in
collaborazione tra Fondazione AMGA e Università degli studi di Brescia. Genova, 18
Novembre 2005
Lucia Bonadonna, Simonetta Della Libera
Dipartimento Ambiente e Prevenzione Primaria
Istituto Superiore di Sanità
e-mail: [email protected]
Nelle acque potabili in distribuzione la flora microbica costituisce una presenza
costante, ma in continua evoluzione. In essa sono rappresentati gruppi microbici diversi,
alcuni dei quali possono essere di derivazione fecale, patogeni e opportunisti patogeni,
organismi quindi che possono costituire un rischio per la salute umana. Altri organismi
rappresentano invece la componente autoctona ed eterotrofa nelle acque che può
comprendere microrganismi resistenti ai trattamenti di disinfezione, capaci di
colonizzare il sistema di distribuzione e amplificarsi selettivamente anche in funzione
dei nutrienti disponibili e delle biocenosi presenti.
Nelle acque destinate al consumo umano il titolo microbico è generalmente basso, a
causa della ridotta concentrazione di nutrienti e dell’effetto dei biocidi che
contribuiscono a limitare la sopravvivenza della flora microbica presente in rete. Pur
tuttavia, può verificarsi che il carico microbico delle acque immediatamente fruibili
possa risultare maggiore rispetto a quello rilevabile nelle acque in entrata in rete.
Molti microrganismi sono in grado infatti di sopravvivere ai processi di
potabilizzazione. Più precisamente, in acque oligotrofe, quali sono quelle potabili, i
microrganismi, costretti ad adattarsi ad un basso tenore di nutrienti, sono in grado di
sviluppare una capacità di adattamento che, tramite una serie di modificazioni
genotipiche e fenotipiche, consente loro di sopravvivere e di moltiplicarsi e, pur
continuando a rimanere metabolicamente attivi, possono perdere la capacità di
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moltiplicarsi in condizioni standard di laboratorio. Si parla quindi di microrganismi
danneggiati (injured) o di “vitali non coltivabili” (VNC). Questo meccanismo è
caratterizzato in generale da un ritmo di respirazione ridotto, da una bassa attività
metabolica e da una lenta utilizzazione delle risorse energetiche. Pertanto, se si tenta di
isolare questi microrganismi, molto spesso essi non vengono rilevati. Questa condizione
di quiescenza, fenomeno molto diffuso nella microbiologia ambientale, rappresenta una
nuova prospettiva e dà un significato dinamico al termine "sopravvivenza". Questo
fenomeno è stato dimostrato prevalentemente per i batteri coliformi, ma anche per altri
batteri eterotrofi. Batteri danneggiati (injured) nelle acque in rete sono quindi in grado
di sopravvivere e, la colonizzazione di zone ad essi favorevoli e protette (fondi rete,
tubercoli e depositi) può permettere lo sviluppo di fenomeni di rivivificazione e, in
alcuni casi, di moltiplicazione.
La presenza di microrganismi nelle acque in distribuzione, oltre a modificare le
caratteristiche organolettiche (odore, sapore) dell'acqua, è causa di problemi operativi
negli impianti idrici riconducibili principalmente a problemi meccanici, di efficienza dei
processi di trattamento dell’acqua e, non ultimi, sanitari.
I biofilm sono patine cellulari continue che si vengono a formare su superfici di diversa
natura immerse in un fluido (aria, acqua). Sono composti da cellule microbiche e
polimeri extracellulari (EPS). Questi ultimi possono essere prodotti da una grande
varietà di microrganismi e costituiscono la matrice primaria del biofilm dove possono
rimanere intrappolati batteri, alghe, protozoi e componenti organici/inorganici. Gli EPS
possono arrivare a costituire il 50-90% del carbonio totale presente nel biofilm e sono
composti principalmente da polisaccaridi, proteine, glicoproteine, LPS e DNA. Sembra
che quest’ultimo svolga un’azione importante nella formazione del biofilm:
Pseudomonas ed altri batteri producono quantità di DNA extracellulare con un
meccanismo che sembra coinvolgere il rilascio attivo di vescicole di piccole dimensioni
dalla membrana esterna.
La formazione di un biofilm è un processo dinamico e complesso che prevede un
susseguirsi di fasi (ancoraggio, adesione e produzione della matrice polisaccaridica).
Durante lo sviluppo del fenomeno, molte possono essere le variabili coinvolte: il tipo di
substrato, l’idrodinamica del sistema e le caratteristiche del mezzo. Inoltre, un ruolo
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determinante spetta alla parete cellulare dei microrganismi che, con l’utilizzo di fimbrie,
pili, produzione di polimeri e capsule e alterando le caratteristiche della parete,
favoriscono la formazione di aggregati cellulari.
Nella prima fase, quella di adesione, le caratteristiche della struttura su cui i
microrganismi andranno ad aderire (PVC, vetro, metalli) rivestono un’importanza
primaria. Ad esempio, un substrato rugoso favorisce più rapidamente l’adesione dei
microrganismi rispetto ad un substrato liscio; l’adesione inoltre è più rapida e facile
sulle superfici idrofobiche.
Il contatto tra superficie solida e liquido sostiene anche il deposito di sostanze
organiche, quali polisaccaridi e glicoproteine, dando origine ad un fenomeno chiamato
“condizionamento”. L’accumulo di queste molecole sull’interfaccia liquido-solido
determina una maggiore concentrazione di nutrienti rispetto alla fase liquida, favorendo
quindi la formazione di una pellicola che altera alcune caratteristiche fisico-chimiche
della superficie (idrofobicità e carica elettrostatica). È in questa fase che i
microrganismi colonizzano più facilmente queste aree dette “condizionate”. Tuttavia, i
legami con il substrato sono ancora deboli (forze di van der Walls, forze elettrostatiche,
interazioni idrofobiche) e le forme microbiche, non in grado di aderire fortemente alla
superficie, restano associati con flagelli e pili. Solo successivamente, con la produzione
di esopolisaccaridi, la coesione diventerà più forte.
La formazione del biofilm avviene mediante stratificazioni successive. Nella struttura,
una matrice eterogenea in cui le microcolonie sono circondate da uno “slime” attraverso
cui si aprono canali interstiziali, fluisce l’acqua che permette la diffusione di nutrienti,
ossigeno, ma anche il passaggio di agenti antimicrobici e disinfettanti.
Non viene escluso comunque l’intervento di specifici segnali intercellulari in grado di
attivare e regolare il trasporto di prodotti batterici. È nota comunque l’esistenza di una
comunicazione intercellulare, definita con il termine di “quorum sensing”. Tramite
questo fenomeno, quando la popolazione microbica ha raggiunto una determinata
densità di crescita, specifiche molecole vengono rilasciate dalle componenti la
biocenosi, con la possibilità di iniziare un secondo ciclo riproduttivo molecolare in
rapporto alle condizioni che si sono venute a creare. Il fenomeno è regolato da
omoserina lattone acetilata (AHLS) per i batteri gram- , e da una varietà di peptidi per i
batteri gram+. Queste sostanze permettono ai batteri di “sentire” o misurare la densità
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microbica e di regolare convenientemente la replicazione in base ad un processo
definito di “autoinduzione” genica.
Le cellule microbiche si moltiplicano utilizzando le sostanze nutritive presenti nel film
di condizionamento e nel fluido circostante, formando delle colonie che si fondono tra
loro e ricoprono poco alla volta tutta la superficie su cui aderiscono. Vengono così, via
via, imbrigliati altri microrganismi, con vantaggio per l’ancoraggio delle cellule al
substrato. La struttura rende le microcolonie meno sensibili alle fluttuazioni
dell’ambiente circostante, anche perché il glicocalice protegge le cellule dalla
disidratazione, trattenendo quantitativi di acqua corrispondenti a parecchie volte il suo
peso e cedendola poi lentamente.
La formazione del biofilm costituisce un processo lento, ma il suo spessore può
raggiungere anche qualche millimetro in pochi giorni. Pellicole formate da colonie
eterogenee sono più spesse e più stabili di quelle monospecifiche. Gli stessi organismi
che compongono un biofilm possono avere un effetto marcato sulla sua struttura, una
specie aumentando la stabilità dell'altra. D’altra parte, la composizione delle specie può
anche dipendere dalla velocità del fluido a contatto con la superficie.
È noto inoltre che l’aderenza a superfici favorisce la maggiore resistenza dei
microrganismi alla disinfezione. Batteri eterotrofi adsorbiti a superfici metalliche
generalmente mostrano una resistenza al cloro circa 2000 volte maggiore di quella delle
stesse specie batteriche presenti allo stato libero nell’acqua.
I fenomeni di formazione di biofilm possono essere favoriti dalle forze di scorrimento
del fluido, dalla presenza di determinati composti e dalle caratteristiche delle singole
specie microbiche.
Quasi tutti i microrganismi vivono in stati di aggregazione e possono contribuire alla
produzione del processo. Nell’ambito dei microrganismi colonizzatori di una superficie
si può notare una vera e propria successione di diverse specie. L’ordine delle
successioni dipende da diversi fattori, primo tra tutti il ciclo vitale, per cui per ogni
microrganismo si alterneranno stadi microbici di adesione a stadi planctonici free-living.
Notevole influenza è data anche da fattori chimico/fisici quali disponibilità e tipologia
dei nutrienti, temperatura, valore del pH, velocità del flusso dell’acqua e torbidità e da
fattori biologici come la competizione tra le specie e la presenza di predatori.
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Nei sistemi di distribuzione delle acque potabili, le specie che concorrono alla
costituzione del biofilm sono ricorrenti, anche se si osservano variazioni nella loro
concentrazione.
I primi colonizzatori sono generalmente batteri pigmentati, appartenenti ai generi
Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Acinetobacter, Sarcina, Micrococcus,
Proteus, Bacillus, attinomiceti e lieviti. Molto spesso si può riscontrare la presenza di
Klebsiella pneumoniae appartenente al gruppo dei coliformi, ed è stato dimostrato che
questo microrganismo ha un maggior successo competitivo rispetto ad altre specie dello
stesso gruppo.
Rare sono le evidenze associate alla presenza di microrganismi patogeni free-living
nelle acque potabili in distribuzione, soprattutto in Italia, anche se diversi patogeni e
potenziali patogeni sono stati isolati da biofilm (Aeromonas, Legionella, protozoi,
micobatteri).
I patogeni alloctoni che partecipano alla formazione della struttura del biofilm hanno
comunque difficoltà a mantenersi vitali a causa delle specifiche necessità di crescita e
della loro incapacità di competere con gli organismi autoctoni. Tuttavia, anche in queste
condizioni, l’adesione contigua e fenomeni di fagocitosi da parte di amebe ambientali
sono fattori che ne favoriscono la sopravvivenza e, come nel caso di Legionella, anche
la moltiplicazione. Inoltre, la specifica architettura del biofilm, anche in questo caso,
rende inefficace l’azione dei biocidi.
L’entità dello sviluppo di biofilm nel sistema idrico varia considerevolmente in base
alla disponibilità dei nutrienti, al tempo di permanenza in rete e alla temperatura
dell’acqua. È stato riscontrato, ad esempio, che la moltiplicazione di Aeromonas è
proporzionale alla formazione potenziale di biofilm nelle condutture. Questa relazione
tra ricrescita di Aeromonas e presenza del biofilm è alla base dell’impiego in Olanda di
questo microrganismo come indicatore della potenzialità di ricrescita batterica nelle reti
(valore guida 200 UFC/100 mL)
Controversa invece è l’opinione degli studiosi sulla presenza di virus, anche se è recente
la segnalazione di un mimivirus all’interno di amebe.
Numerosi sono i materiali che vengono oggi usati nella costruzione di impianti di
distribuzione delle acque destinate al consumo umano: acciaio zincato, ghisa, rame,
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ferro galvanizzato, calcestruzzo, polivinilcloruro (PVC), polibutilene (PB), polietilene
ad alta densità (PEAD); questi materiali possono essere utilizzati come componenti
delle stesse tubature, nei raccordi, guarnizioni e altri accessori per il trasporto dell’acqua
alle utenze. È stato dimostrato che alcuni materiali sono in grado più di altri di
consentire colonizzazioni e sviluppo di nicchie di moltiplicazione e resistenza
microbica.
Ad esempio, nelle condotte formate prevalentemente da ferro come materiale si
registrano interferenze tra i prodotti derivanti dalla corrosione ed il cloro libero, e questo
processo porta ad una domanda di cloro 10 volte maggiore rispetto a tubazioni di altro
materiale.
Nel biofilm sono presenti anche batteri che possono essere responsabili della corrosione
delle condotte e delle tubature: generalmente si tratta di microrganismi ambientali che
non hanno rilevanza sanitaria ( ferrobatteri, batteri solfato riducenti, tiobacilli e batteri
eterotrofi). Le loro concentrazioni nelle reti possono essere molto elevate.
In questi casi, nella struttura del biofilm prevalgono composti inorganici e lo sviluppo
del fenomeno è il risultato di processi galvanici prodotti all’interno e all’esterno delle
condotte metalliche, spesso favoriti da attività microbica e da fattori che rendono
l’acqua aggressiva per caratteristiche legate a pH acido, a un grado elevato di durezza, a
presenza di cloruri e/o solfati. L’attività microbica può inoltre aumentare l’accumulo di
ossidi di ferro, alluminio, manganese, silice, carbonato di calcio e di altri composti
inorganici che, come prodotti della corrosione, possono rappresentare un fattore
aggiuntivo di protezione nei confronti degli organismi.
I microrganismi possono provocare corrosione nelle condotte metalliche delle reti
idriche anche riducendo l’ossigeno disciolto, liberando metaboliti corrosivi, producendo
acido solforico e partecipando al processo catodico. Gli stessi organismi sono anche la
causa del biodeterioramento di materiali utilizzati nelle tubature, come le plastiche e le
gomme, che possono così rappresentare una fonte di nutrienti organici che ne
sostengono la crescita.
La presenza di microrganismi ambientali può anche essere responsabile di occlusioni
del lume delle tubature con conseguente ridotta portata idrica. Alcuni dei microrganismi
spesso riscontrati in associazione a questi fenomeni possono dare origine a torbidità e
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colorazioni delle acque osservabili, anche alle utenze, soprattutto dopo stagnamento di
acqua nei tubi.
La presenza e la persistenza di diverse specie microbiche in biofilm anche esposti
all’azione di disinfettanti può costituire un problema cruciale nelle procedure di
controllo della qualità delle acque potabili. Molti organismi, tra cui anche i patogeni,
aggregati e successivamente rilasciati nel flusso d’acqua possono giungere ai rubinetti
dei consumatori. Da ciò deriva l’opportunità di controllare e minimizzare l’attività
microbica nei sistemi di distribuzione dell’acqua, con un processo che può essere
condotto solo mediante una combinazione di misure preventive. Anche se non esistono
criteri globali applicabili a tutti i sistemi, in generale, le strategie di controllo
dovrebbero principalmente considerare le possibili relazioni tra le densità microbiche e i
parametri gestionali e di manutenzione degli impianti. Anche misure di attività
microbica con sistemi rapidi di determinazione (ATP) potrebbero contribuire allo
svolgimento di attività di sorveglianza e prevenzione dei danni causati da questi
fenomeni.
Riferimenti bibliografici
1. Italia. Decreto 4 aprile 2004, n. 174. Regolamento concernente i materiali e gli
oggetti che possono essere utilizzati negli impianti fissi di captazione, trattamento,
adduzione e distribuzione delle acque destinate al consumo umano. Gazzetta
Ufficiale – Serie Generale n. 166, 17 luglio 2002.
2. Van Delden C. Virulence factors in P. aeruginosa. In: Pseudomonas, genomics, life
style and molecular architecture. Ramos JL ed. Granada: CSIC, 2004.
3. McFeters GA. Biofilm development and its consequences. In: Microbial adhesion
and aggregation. KC Marshall ed. Berlin: Springer-Verlag, 1984.
4. Geldreich EE. Microbial quality of water Supply in distribution systems. Boca
Raton, Florida: CRC Press, Inch, 1996.
5. Fletcher M. Bacterial attachment in aquatic environments: a diversity of surfaces
and adhesion strategies. In: Bacterial adhesion. Fletcher M. ed. New York: WileyLiss, 1996.
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6. Wingender J, Gobe S, Fiedler S and Flemming HC. The effect of extracellular
polysaccarides on the resistance of Pseudomonas aeruginosa to chlorine and
hydrogen peroxide. In: Biofilms in the aquatic environment. CW Keevil, A Godfree,
D Holt and C Dow ed. Cambridge: The Royal Society
7. Theron J, Cloete TE. Emerging waterborne infections: contributing factors, agents,
detection tool. Crit Rev Microbiol 2002; 28 (1): 1-26
8. Legnani P., Leoni E., Soppesa F, Brigo R. The occurrence of Aeromonas species in
drinking water supplies of an area of the Dolomiti Mountantains, Italy. J. Appl.
Microbiol 1998; 85: 271-6