17-OH-Progesterone ELISA

Istruzioni per l’Uso
17-OH-Progesterone
ELISA
Saggio immunoenzimatico per la determinazione diagnostica in vitro
quantitativa di 17-OH-progesterone in siero e plasma umano.
RE52071
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
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www.IBL-International.com
17-OH-Progesterone ELISA (RE52071)
1.
ITALIANO
USO PREVISTO
Saggio immunoenzimatico per la determinazione diagnostica in vitro quantitativa di 17-OH-progesterone in
siero e plasma umano.
2.
SOMMARIO E SPIEGAZIONI
L’ormone steroideo progesterone 17-OH (17-OHP) è prodotto nella corteccia surrenalica e nelle gonadi.
L’azione gestagenica esercitata dal 17-OHP è modesta. Quest’ormone è tuttavia significativo dal punto di
vista clinico in quanto rappresenta il principale precursore del11β-desossicortisolo (composti, CpS). Il CpS si
forma per idrossilazione dell’atomo di carbonio C 21. L’attività enzimatica della 21 idrossilasi nella corteccia
surrenalica si può quindi monitorare analizzando il livello di 17-OHP nel sangue.
Il deficit di 21 idrossilasi, che si riscontra normalmente nell’iperplasia surrenalica congenita, causa una
secrezione eccessiva di 17-OHP e, di conseguenza, valori ematici superiori alla media. Il deficit di 11idrossilasi, comunque, causa un’alterazione solo moderata di 17-OHP. L’analisi dell’ormone steroideo è
quindi significativa nella diagnosi differenziata dell’iperplasia surrenalica congenita.
Nelle donne adulte, non in stato di gravidanza, i livelli di 17-OHP nel sangue dipendono dalla fase del ciclo
mestruale. Come il progesterone, il 17-OHP è secreto dal follicolo maturo e dal corpus luteum. Le
concentrazioni in generale sono maggiori dopo l’ovulazione.
I livelli di 17-OHP vengono inoltre influenzati dai ritmi giornalieri che sono correlati alla secrezione surrenale
di cortisolo. Livellli massimi di 17-OHP si riscontrano in campioni raccolti tra le 24.00 e le 8.00 del mattino.
Negli uomini adulti esistono scarse indicazioni riguardo a simili fluttuazioni dei livelli di 17-OHP.
Durante la gravidanza feto, placenta e corteccia surrenalica producono grandi quantità di 17-OHP. L’ormone
è secreto nella circolazione sanguigna fetale e materna. I valori di 17-OHP nella madre aumentano
notevolmente dopo la 32° settimana di gravidanza, raggiungendo livelli 4 volte superiori rispetto alla fase
luteale del ciclo mestruale. Il 17-OHP si riscontra anche nel cordone ombelicale del neonato.
3.
PRINCIPIO DEL TEST
Test immunoenzimatico assorbente su fase solida (ELISA) basato sul principio di competizione. Una
quantità sconosciuta dell’antigene presente nel campione e una quantità fissa di antigene legato all’enzima
competono per i siti di legame sugli anticorpi che rivestono i pozzetti. Dopo incubazione i pozzetti vengono
lavati per bloccare la reazione di competizione. Successivamente alla reazione del substrato l’intensità del
colore sviluppato è inversamente proporzionale alla quantità dell’antigene presente nel campione. I risultati
dei campioni possono essere determinati direttamente usando la curva standard.
4.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale.
2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi
di aver compreso tutte le indicazioni.
3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento
della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme
al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore.
4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i
reagenti scaduti.
5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in
lattice e occhiali protettivi se necessario.
6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed
occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di
sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore.
7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi
secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato.
8. Il personale delle pulizie dev’essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle
procedure da adottare.
9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle.
10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e
HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in
maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi.
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5.
ITALIANO
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 °C. Non esporre a luce
solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e
dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente.
La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso
riposta a 2–8 °C.
6.
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
Siero, Plasma (EDTA)
Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l’integrità del campione di
sangue dal momento del prelievo al momento dell’esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati,
itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro
interno.
Conservazione:
Stabilità:
7.
2-8°C
7 giorni
≤ -20°C (Aliquote)
3 mesi
Non esporre alla luce solare diretta e al calore.
Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento.
MATERIALE FORNITO
Quantità
Simbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 20 mL
ENZCONJ
Componente
Micropiastra
Strisce separabili.
Coniugato con anti-coniglio IgG. (capra, policlonale), 17-OH-Progesterone Antisiero.
Coniugato Enzimatico
Di Colore Giallo. Pronto/a all’uso. Contiene: 17-OH-Progesterone, coniugato a HRP,
tampone fosfato, stabilizzatori.
Standard A-G
1 x 2.0 mL
6 x 1.0 mL
CAL A-G
2 x 1.0 mL
CONTROL 1+2
1 x 50 mL
WASHBUF CONC
1 x 15 mL
TMB SUBS
1 x 15 mL
TMB STOP
3x
FOIL
0; 0.15; 0.5; 1.5; 3.0; 7.5; 20 ng/mL
0.45; 1.5; 4.5; 9.1; 22.7; 60.6 nmol/L
Pronto/a all’uso. Standard A = Zero Standard (siero privo di steroidi).
Contiene: 17-OH-Progesterone, Siero umano, stabilizzatori.
Controllo 1+2
8.
Pronto/a all’uso. Per le concentrazioni /gli intervalli accettabili vedere le etichette
sulle provette.
Tampone Lavaggio Concentrato (20x)
Contiene: tampone fosfato, Tween, stabilizzatori.
Soluzione Substrato TMB
Pronto/a all’uso. Contiene: TMB, Tampone, stabilizzatori.
Soluzione Stop TMB
Pronto/a all’uso. 1 M H2SO4.
Pellicola Adesiva
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
1.
2.
3.
4.
5.
Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 5; 25; 50; 100; 500 µL
Vortex mixer
Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti
Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico
Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm
(lunghezza d’onda di riferimento 600-650 nm)
6. Acqua bidistillata o deionizzata
7. Carta assorbente, puntali per pipette e timer
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ITALIANO
NOTE PER LA PROCEDURA
1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati.
Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento
dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate.
2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti
siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai
campioni e ai componenti del kit (18-25 °C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e
campione prima dell’uso. Non creare schiuma durante il mescolamento.
3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per
ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non
utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti.
4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento.
5. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un’appropriata distribuzione sulla piastra.
6. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso
ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le
soluzioni in tutti i pozzetti.
7. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a
risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far
asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e
aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti
siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti.
8. L’umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l’involucro finché non ha raggiunto la temperatura
ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell’involucro con il disseccante.
10.
ISTRUZIONI PRE-TEST
10.1. Preparazione di componenti liofilizzati o concentrati
Diluire /
dissolvere
Componente
15 mL
WASHBUF CONC
fino a
300 mL
Diluente
Rapporto
Note
Conservazione
Stabilità
acqua
bidist.
1:20
Mescolare
energicamente.
2-8°C
4 settimane
10.2. Diluizione dei Campioni
I campioni sospettati di avere una concentrazione superiore a quella dello standard con concentrazione più
alta devono essere diluiti con Standard A.
11.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
PROCEDURA DEL TEST
Pipettare 25 µL di Standard, Controllo e campione nei rispettivi pozzetti della Piastra Microtiter.
Pipettare 200 µL di Coniugato Enzimatico in ogni pozzetto.
Coprire la piastra con pellicola adesiva. Agitare delicatamente la piastra. Incubare 60 min a TA
(18-25°C).
Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d’incubazione. Lavare la piastra 3 volte con
250 µL di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l’eccesso di soluzione picchiettando la piastra
capovolta su una salvietta di carta.
Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali.
Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. Usare uno spostamento
positivo ed evitare la formazione di bolle d’aria.
Pipettare 100 µL di Soluzione Substrato TMB in ogni pozzetto.
Incubare 30 min a TA (18-25°C).
Fermare la reazione substrato aggiungendo 100 µL di Soluzione Stop TMB in ogni pozzetto.
Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra.
Misurare la densità ottica con un fotometro a 450 ± 10 nm (Lunghezza d’onda di riferimento:
600-650 nm) entro 30 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop.
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ITALIANO
CONTROLLO DI QUALITA’
I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l’uso. L’utente deve
inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli
utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche
di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e
il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni
laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi
di controllo qualità periodici.
In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di
conservazione, pipette, strumenti, condizioni d’incubazione e metodi di lavaggio.
13.
CALCOLO DEI RISULTATI
La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione
(asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si
ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log.
Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei
duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile).
La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard.
I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel
paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati.
Conversione:
17-OH-Progesterone (ng/mL) x 3.03 = nmol/L
(OD)
1.500
Tipica Curva di Calibrazione
(Esempio. Non usare per il calcolo!)
Standard
17-OHProgesterone
(ng/mL)
A
0.00
B
0.15
C
0.50
D
1.50
E
3.00
F
7.50
G
20.00
14.
DOMedia
DO/DOmax
(%)
1.487
1.276
1.015
0.691
0.496
0.274
0.152
100.00
85.80
68.30
46.50
33.30
18.40
10.20
17-OH-Progesterone ELISA
1.250
1.000
0.750
0.500
0.250
0.000
0.01
0.10
1.0
10.0
100.0
(ng/mL)
VALORI ATTESI
I soli risultati non dovrebbero essere l’unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere
correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici.
Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori:
17-OH-Progesterone (ng/mL)
Donne
Phase
Media
Intervallo
N
Fase Follicolare
0.51
0.3 – 1.0
16
Fase Luteale
0.96
0.2 - 2.9
16
dopo stimolazione ACTH
Gravidanza (terzo trimestre)
1.4
9.1
<3
1.8 – 20.0
17
52
Uomini
Media
Intervallo
N
0.75
0.05 - 1.6
48
Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento.
15.
LIMITI DELLA PROCEDURA
I seguenti componenti del sangue non hanno effetto significativo (+/-20%) sui risultati del test fino ai livelli di
concentrazione riportati in tabella:
Emoglobina
Bilirubina
Trigliceridi
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8.33 mg/mL
0.33 mg/mL
0.25 mg/mL
4/5
17-OH-Progesterone ELISA (RE52071)
16.
PERFORMANCE
Specificità Analitica
(Reattività Crociate)
Sensibilità Analitica
(Limite di Rilevazione)
Precisione
Intra-Saggio
Inter-Saggio
Linearità
Recupero
Metodo di Paragone
verso GCMS
17.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
ITALIANO
Sostanza
17α-OH-Pregnenolone
Progesterone
11-Desossi-Cortisolo
Desossi-Corticosterone
Cortisolo
Pregnenolone
0.03 ng/mL
Reattività Crociate (%)
1.7
1.4
1.3
0.12
0.013
0.012
Cross-reattività di altre
sostanze esaminate ≤ 0.001 %
Media (Zero-Standard) - 2SD
Intervallo (ng/mL)
2.44 – 11.41
0.26 – 5.74
Intervallo (ng/mL)
1.56 – 9.23
Media (%)
101
CV (%)
2.8 – 4.9
5.8 – 9.2
Diluizioni Seriali fino a Intervallo (%)
1:16
80 - 120
Intervallo (%)
% Recupero dopo i picchi
80 - 121
Test IBL = 1.31 x GCMS – 0.45
r = 0.94; n = 22
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
Sahin Y and Kelestimur F. 17-Hydroxyprogesterone responses to gonadotrophin-releasing hormone
agonist buserelin and adrenocorticotrophin in polycystic ovary syndrome: investigation of adrenal and
ovarian cytochrome P450c17alpha dysregulation. Hum. Reprod., 12: 910-913 (1997)
Liovic M et al. CYP17 gene analysis in hyperandrogenised women with and without exaggerated 17hydroxyprogesterone response to ovarian stimulation. J. Endocrinol. Invest., 20: 189-193 (1997)
Oriola J et al. Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gene. Clin. Chem.,
43: 557-561 (1997)
Ibanez L et al. Ovarian 17-hydroxyprogesterone hyperresponsive-ness to gonadotropin-releasing
hormone (GnRH) agonist challenge in women with polycystic ovary syndrome is not mediated by
luteinizing hormone hypersecretion: evidence from GnRH agonist and human chorionic gonadotropin
stimulation testing. J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: 4103-4107 (1996)
Bernini GP et al. 17-Hydroxyprogesterone response to ACTH in bilateral and monolateral adrenal
incidentalomas. J. Endocrinol. Invest., 19: 745-752 (1996) J. Assist. Reprod. Genet., 13: 681-682 (1996)
Glock Jl et al. The relationship of corpus luteum volume to relaxin, estradiol, progesterone, 17hydroxyprogesterone and human chorionic gonadotropin levels in early normal pregnancy. Early
Pregnancy, 1: 206-211 (1995)
Berkow R, Fletcher AJ, Beers MH.Congenital Adrenal Hyperplasia. In ”The Merck Manual of Diagnosis
and Therapy“, pp 2224-2226, Merck & Co., Inc., 16th edition 1992
Chrousos GP, Loriaux DL, Mann DL, Cutler GB. Lateonset 21-Hydroxylase deficiency mimicking
idiopathic hirsutism or polycystic ovarian disease. Ann. Int. Med. 96: 143 (1982).
Schnakenburg K, Bindlingmaier F, Knorr D. 17-hydroxy-progesterone, androstendione, and
testosterone in normal children and in prepubertal patients with congenital adrenal hyperplasia. Eur. J.
Pediatr. 133: 259 (1980).
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbH
Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany
IBL International Corp.
194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada
Tel.:
E-MAIL:
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and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20