filtrazione spettrofotometria

FILTRAZIONE
Materiale occorrente
Attrezzature per la filtrazione:
- Pompa da vuoto (aspirante)
- Apparato filtrante
- Beuta grande + tappo con cannula rivestito di isolante stagno
- Tubo che collega l'apparato filtrante col tappo della beuta
- Tubo con “sifone” (per accumulo o sfiato) che collega la beuta con la pompa
- Filtri in fibra di vetro (GF/F, Ø 25mm)
Attrezzatura di supporto:
- Acetone neutralizzato filtrato (100% e/o 90% e/o 80%)
- Acqua distillata con Spruzzetta
- 2 Pinzette
- Pipetta + Palla di Peleo (propipetta)
- Provette + Portaprovette
- Imbuto in plastica
- Cilindri graduati
- Matita e Targhette Adesive (per identificare le provette)
- Frigorifero o Congelatore
- DataLog: foglio su cui annotare tutti i dati dei campioni
Procedura analitica:
1. Preparazione dei reagenti
- Acetone neutralizzato filtrato (100% e/o 90% e/o 80% ):
l'eventuale acqua che potrebbe essere presente nell'acetone va eliminata con l'aggiunta di un
eccesso di Carbonato di Sodio anidro.
Si agita quindi vigorosamente e si lascia agire per almeno 24 ore.
A questo punto si filtra su carta da filtro
2. Preparazione dell'apparato e Filtrazione
- Montare con attenzione tutto l'apparato “pompa – beuta – apparato filtrante”
Il tubo contenente il sifone collega le pareti laterali della beuta con la pompa (accertarsi che
la parte della pompa collegata sia quella aspirante e non quella che ributta l'aria all'esterno).
L'altro tubo collega il sistema filtrante col tappo che va inserito nella beuta (inserirlo bene a
pressione)
- Inserire il filtro nell'apparato di filtrazione
Non importa il verso del filtro, l'importante è che sceltone uno si usi sempre lo stesso
- Bagnare i filtri con un goccio di acqua distillata o acqua di mare filtrata prima di iniziare
- Iniziare a riempire il datalog e preparare le provette e le targhette con le stazioni, la data...
- Avvinare il tubo graduato ogni volta che filtriamo un nuovo campione
- Agitare delicatamente (per evitare la rottura delle cellule) la tanica contenente l'acqua
campionata da filtrare
- Riempire il cilindro graduato prendendo nota sul data-log dei litri che man mano vengono
filtrati
- Inserire l'acqua da filtrare nel bicchiere del sistema filtrante
- Accendere la pompa
N.B. Fare sempre attenzione che il manometro della pompa rimanga sotto i 150 mm Hg,
anche meno, onde evitare la rotture di cellule vegetali e il conseguente passaggio di pigmenti
attraverso il filtro
- Versare, man mano che viene filtrata, altra acqua nel filtratore, riempiendo di nuovo il
cilindro graduato fino ad esaurimento del campione, o comunque fino ad intasamento del
filtro, tenendo sempre aggiornato il datalog sui Volumi d'acqua che man mano vengono
filtrati
FATTORI IMPORTANTI
Pressione → non troppo alta, altrimenti filtrazione troppo veloce con probabili danni a
cellule e/o filtri
Tempo → la filtrazione va fatta entro 4-6 ore al massimo (anche meno, 1-2) dal
campionamento, specie in ambienti eutrofici
Luce → la filtrazione va fatta al buio o comunque con luce bassa, per due motivi:
1. Onde evitare che continui la fotosintesi e si falsino i dati
2. Perchè i pigmenti sono fotolabili
3. Finito di filtrare:
- Prendere il filtro con le pinzette (facendo attenzione a non toccare l'area con i pigmenti),
piegarlo in 4 e inserirlo in una provetta.
- Quindi aggiungere:
∙ Se verrà effettuata subito l'analisi spettroscopica →
→ Un volume noto (*5 ml) di Acetone 90% neutralizzato
∙ Se l'analisi spettroscopica verrà effettuata in seguito →
→ Un volume noto (5* ml) di Acetone 100% neutralizzato e conserviamo in congelatore a
-20°C
* 5 ml = Volume Estratto
N.B. Per la determinazione della concentrazione dei pigmenti è importante non soltanto la
conoscenza del Volume di acqua che filtro, ma anche il volume finale che avrò nella
provetta (Volume Estratto). Quindi mi devo sempre segnare (sul datalog) tutti i Volumi
con cui lavoro e le eventuali variazioni
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER L'ANALISI
SPETTROFOTOMETRICA
Materiale occorrente
- Pestello (in vetro)
- Acetone filtrato (80% o 90% a seconda del campione, vedi avanti)
- Pipetta e Palla di Peleo
Procedura analitica:
1. Triturare (e omogenizzare) il filtro:
a. Pestare i filtri:
- pestare i filtri nella provetta con un pestello fino a ridurli in pezzettini, poltiglia. Quindi
b. Aggiungere 5 ml di Acetone filtrato (porto a Volume finale → 10 ml):
- all'80% per i campioni che sono stati conservati in congelatore (dove avevamo messo
già 5 ml di Acetone al 100%
- al 90% per i campioni preparati poco prima (dove avevamo messo già 5 ml di Acetone
90%)
Dovrò avere: * Volume estratto finale 10 ml, Diluizione al 90%
Mentre spruzzo l'Acetone con la pipetta nella mia provetta, faccio risalire pian piano il pestello
(gli spruzzo l'acetone sopra), così che estraendo il pestello dalla provetta non rischio di
portarmi via eventuali pezzi di filtro e contemporaneamente lo pulisco per poi poterlo utilizzare
per pestare il filtro successivo (dopo averlo asciugato con carta assorbente).
2. Completare l'estrazione facendo riposare in frigo:
- Triturato il filtro, il campione da analizzare va fatto riposare in frigo a +4°C per 24 ore
prima di effettuare la lettura spettrofotometrica affinchè si completi l'estrazione dei pigmenti.
3. Centrifugare le provette:
a. Dopo che le provette hanno riposato le tiro fuori dal frigo e le preparo per la centrifuga:
- Prima di tutto peso le provette → devono pesare tutte uguali, al max ci può essere una
differenza di 0.02 g (se sono troppo diverse uso dello scotch per appesantire la più
leggera.
- Quindi carico la centrifuga → la centrifuga va caricata in modo bilanciato. La nostra è da
6 posti, quindi o metto 3 provette
oppure ne metto 6.
b. Quindi centrifugo le provette chiuse per 15-20 minuti a 4000 giri/min (rpm).
[Tra le impostazioni della centrifuga: “freno acceso”, per una maggior sicurezza].
4. Prelievo del sopranatante e riempimento delle cellette dello spettrofotometro
- Prelevare il sopranatante mediante una pipetta o una siringa, facendo attenzione a non
risospendere il precipitato.
- Avvinare, usandone una piccola quantità, le cellette dello spettrofotometro, e quindi
riempirle col sopranatante.
ANALISI SPETTROFOTOMETRICA
Materiale occorrente
- Spettrofotometro
- Cellette con campione
- Pipetta di Gilbert da 100 µl + puntali
- Acido Cloridrico 0,66 M (mol/dm3)
- Acetone neutralizzato (90%)
Procedura analitica:
1. Accendere lo spettrofotometro almeno 15 min prima di fare la misura
2. La scelta del percorso ottico delle cuvette va effettuata in funzione del grado di diluizione
degli estratti.
3. Quindi faccio fare il bianco (con Acetone non neutralizzato 90%) per tutto lo spettro:
“Calibra”.
4. Inserisco quindi la celletta con l'estratto da analizzare.
5. Misurare l'assorbanza a 750 nm (λ alla quale i pigmenti non assorbono) → deve essere
inferiore a “0.002 ∙ 5” cm (unità di cammino ottico) = 0.01 unità di assorbanza.
N.B. La lettura dell’estratto a 750 nm serve a misurarne la torbidità. Ad esempio: utilizzando
una cuvetta di 10 cm di cammino ottico, deve essere inferiore a 0,02 unità di assorbanza.
6. Effettuare quindi le misure alle diverse lunghezze d'onda desiderate, a seconda dei pigmenti
d'interesse (vedi letteratura). Per la Clorofilla a ci interessano le λ a 664 e 665 nm (ne
leggiamo anche altre perchè ci interessano altri pigmenti, quali la Clorofilla-b, c e i
carotenoidi)
7. Effettuare inoltre le misure a 750 e 665 nm dopo acidificazione del campione con HCl 0,66 M
per la determinazione dei feopigmenti [utilizzare 10μl (Lazzara; secondo ispra 30μl) di HCl
ogni ml di estratto (10 ml circa) → 100 μl].
Introdotto l'HCl mescolare un po' con il puntale della Gilbert affinchè l'HCl si distribuisca in
tutto il campione, quindi attendere qualche minuto per la degradazione a feofitina di tutta la
clorofilla. Effettuare la lettura quando il valore di assorbanza si è stabilizzato, alle lunghezze
d’onda di 750 nm e 665 nm.
Le letture dell’estratto acidificato hanno valori di assorbanza inferiori alle corrispondenti del
campione non acidificato ed il rapporto tra i picchi di assorbimento (664/665) varia da 1,0 (nel
caso siano presenti solo prodotti di degradazione) a 1,7 (nel caso sia presente solo clorofilla).
Prima di procedere alla lettura del campione successivo lavare accuratamente la cella con la
soluzione di acetone 90% per eliminare ogni traccia di acido.
8. * Per tutte le misure da effettuare e i calcoli da fare per ottenere le concentrazioni vedere
“Pigmenti Clorofilliani, Lazzara et al., Nova Thalassia, Vol. 11, pag 207-223, anno 1990”