programma corso biologia molecolare - ANL

PROGRAMMA CORSO BIOLOGIA MOLECOLARE --- PROF. ROVIGATTI
ACCADEMIA NAVALE DI LIVORNO (ANL) --- AA 2012-2013
1° Lezione: Venerdì 08 FEBBRAIO 2013.
REGISTRO: 1. Introduzione corso. La Biologia Molecolare è estremamente importante in Medicina. 2. Nobels
in
Medicina 2000-12. Ci soffermiamo su 2012: John Gurdon e Shinya Yamanaka. Pietre Miliari: 1865,71, 1903, 1910,
1931, 1944.
3.
Esperimenti di F. Griffith, O. Avery, A. Hershey e M.Wigler/R. Axel.
DETTAGLIATO: Presentazione del Corso: testi consigliati di JD. Watson, B. Lewin e E. Allison. Ulteriori testi di
consultazione. 2/3 dei premi Nobel ultimi 50 anni assegnati per ricerche di BM. Assegnazione del Premio Nobel per la Medicina
e Chirurgia a Elisabeth Blackburn, Carol Greider e Jack Shostack nel 2009.
Natura e funzione dei telomeri e della telomerasi. Problema della replicazione delle estremità (End Replication Problem). Cenni
su Replicazione DNA: DNA polimerasi, direzione 5’-à3’, primers, frammenti Okazaki, cromosomi, numeri/valori x geni-genoma. L.
Hayflink, J. Shay: la basi cellulari, citologiche e molecolari della senescenza. Mantenimento dei telomeri, telomerasi (Th. Cech e
J. Lingner), inizio del ciclo Breakage-Fusion-Bridge (BFB) e sue importanti conseguenze per l’instabilità genomica e per la
carcinogenesi (McClintock).
Pietre miliari ed albori BM: 1865, 1871, 1903, 1910, 1913, 1927, 1931 (Mendel, Miescher, Correns, Tschermak, DeVries, Thomas
Hunt Morgam, Bridges, Sturtevant, fino a B. McClintock). Sutton e la teoria cromosomica dell’ereditarietà. Esordi alla Scuola di
Thomas Hunt Morgan. Moscerino occhi bianchi: incroci x wt e Back-Crossing.
Due lavori emblematici del gruppo di Roland De Pinho (MD Anderson Cancer Institute) e di Inder Verma (Salk Instute, San
Diego) dimostrano l’importanza della Telomerasi per la senescenza e di Satelliti del DNA centromerico per la carcinogenesi
indotta da mutazioni BRCA1-,
1
Prime mappe genetiche approntate da Sturtevant. Terminologia di Johanssen e di Bateson. Esperimenti su natura del materiale
ereditario di F. Griffith (1928): principio trasformante. Esp. di Avery, McLead & McCarthy (1944), di A. Hershey e M. Chase
(1952) e di M. Wigler e R. Axel.
2° lezione: Venerdì 15 FEBBRAIO 2013.
REGISTRO: 1. Conclusione esperimenti di M. Wigler e R. Axel e loro implicazioni. Herman Muller: induzione mutazioni
con X-rays. Concetto mutazione. 2.
G. Beadle e E. Tatum. Mappatura pathways metabolici. Clonazione gene
alcaptonuria (HGO). Genetica diretta
3.
Genetica Inversa.
Genes as “beads on strings”.
S. Luria e M.
Delbruck (fluctuation test): Introduzione.
DETTAGLIATO: Ulteriori libri di testo di B. Lewin, M. Cummings, Stracham & Reed, siti internet a partire
da www.ncbi.nlm.nih.gov . Bioetica e Elisabeth Brackburn (articolo NEJM). Attualità Biologia Molecolare. Sua rilevanza per le
ricerche biomediche. BM permea ormai tutti i campi della medicina.
Il DNA è materiale ereditario di batteri, virus ed eucarioti: Esperimenti di F. Griffith (1928): principio trasformante. Esp.
di Avery, McLead & McCarthy (1944), di A. Hershey e M. Chase (1952) e di M. Wigler e R. Axel (1978). Importanza metilazione
per la deaminazione di C e sue conseguenze. Presenza di isole CpG e loro importanza per la regolazione dei geni housekeeping.
Transizioni e Transversioni.
Dettagli esperimento M. Wigler. Calcolo della frequenza dei siti di taglio enzimi di restizione. Isolamento frammenti di DNA
HSV-TK e loro trasfezione. Importanza dell’esperimento di Wigler per: 1) maggior semplicità modello virale, 2) particolare
selezione gene TK con cocktail HAT; 3) metodi di trasfezione permetteranno di selezionare/isolare singoli geni.
Isolamento frammenti di DNA HSV-TK e loro trasfezione in cellule di topo L-TK-; 4) Dimostrazione mediante elettroforesi su
gel di poli-acrilamide della presenza di due attività enzimatiche distinte di TK in cellule L trasfettate.
Calcolo dimensioni genomi, numero geni, dimensioni medie di un gene, dimensioni medie di una proteina codificata dal gene.
2
Esordi alla Scuola di Thomas Hunt Morgan. Moscerino occhi bianchi: incroci x wt e Back-Crossing. Prime mappe genetiche
approntate da Sturtevant. Terminologia di Johanssen e di Bateson.
Esperimenti di Herman Mueller (esercitazione/animazione da DNAftb) determinano presenza geni m oltre che l nel topo, i quali
causano letalità nei maschi ma non nelle femmine. I geni m ed l sono ovviamente recessivi ed appaiono nei maschi in quanto
eredità legata al sesso.
A. Garrod (1908) e gli inizi della genetica metabolica (inborn errors of metabolism). L’alcaptonuria: gene isolato e studiato
dopo 50 anni. Genetica di Apergillus e altre muffe. Irraggiamento con X-rays dei conidi ed utilizzo di ascospore aploidi.
L’alcaptonuria: gene autosomico recessivo: mappaggio su 3q2: sua clonazione circa 60 anni dopo il lavoro di Garrod e grazie
all’iniziale clonazione da Aspergillus. Esperimenti di Genetica Diretta e di Genetica Inversa (Charles Weissmann). Esercitazione
di mappatura di pathway metabolici studiati con la metodologia di Beadle e Tatum. Pathway Ornitina-> Citrullina-> Arginina.
Esempio di complementazione.
3° lezione: Venerdì 27 FEBBRAIO 2013.
REGISTRO: 1. Luria-Delbruck: test di fluttuazione. Calcolo della frequenza di mutazioni mediante equazione di Poisson.
Hanahan & Weinberg: “Hallmarks of Cancer”. 2.
Paradosso cancro: ci soffermiamo su: Loeb, Bodmer, Vogelstein,
Duesberg. Cairns: mutazioni adattative. 3.
Saymour Benzer e la struttura fine del gene. Regolazione espressione
genica: introduzione
DETTAGLIATO: Albori della biologia molecolare: suo rapporto con la fisica/fisici teorici. Affinità fra concetti struttura
materia (nucleo) e strutture biologiche (gene): Thompson, Rutherford, Niels Bohr.
Esperimento di Luria-Delbruck: premesse concettuali, selezione darwiniana vs. adattamento lamarckiano. La figura di S. Luria:
fuga dall’Italia e dall’Europa per regimi fascista/nazista. A slot machine, a broken test-tube. Test di fluttuazione di LuriaDelbruck: premesse storiche-logiche, esecuzione, interpretazione e calcolo con equaz. Poisson. Esperimento Luria-Delbruck:
3
effetti non-casuali. Calcolo frequenze mutazione con equazione di Poisson Px= h x . e –h / X!. Dimensione dei genomi e dei geni:
calcoli generali per E. Coli e per H. Sapiens: % dei genomi corrispondenti a frazioni codificanti. Dibattito Lamarkiano: studi di
August Weissman (amputazione coda topi). Studi di J. Cairns su mutazioni adattative. Interpretazione e meccanismo. Mutator
phenotype e potenziali implicazioni per la carcinogenesi.
Ripetizione/Esercitazione. Calcolo frequenze mutazione con equazione di Poisson Px= hx . e-h / X! Studi di J. Cairns su mutazioni
adattative. Interpretazione e meccanismo. Mutator phenotype e potenziali implicazioni per la carcinogenesi. Larry Loeb: teoria
per spiegare l’alta frequenza di mutazioni delle cellule neoplastiche. 1. alta frequenza di mutazioni adattative con effetti
secondari (high rate, small effects); 2. le importanti implicazioni di mutazioni adattative per l’evoluzione e 3. le mutazioni
adattative come meccanismo evolutivo –simile alla senescenza o all’apoptosi- con coinvolgimento di polimerasi κ e ζ. e 3. le
mutazioni adattative come meccanismo evolutivo –simile alla senescenza o all’apoptosi- con coinvolgimento di polimerasi che
permettono sintesi dopo una lesione (Trans-Lesion Synthesis, TLS). Implicazioni per il Modello di Hanahan e Weinberg, il
quale prevede almeno 6 diverse mutazioni in geni che coinvolgano: 1. Regolazione attiva del ciclo (esemplificazione : oncogene); 2.
Inibizione del ciclo (esemplificazione: oncosoppressore); 3. Regolatore senescenza/immortalizzazione (esemplificazione: gene
che controlla telomeri, telomerasi); 4. Regolazione dell’apoptosi (indotta by default col fallire di 1-3); 5. Regolazione
dell’angiogenesi; 6. Geni coinvolti processo Metastatizzazione.
Ripetizione concetti su mutazioni casuali/adattative e loro implicazioni per carcinogenesi. Luria-Dehlbruck - John Cairns 
Hanahan-Weinberg  Larry Loeb. Drammaticità del problema cancro per la specie umana: 1 maschio su 2 ne è colpito ed una
femmina su tre. Mentre malattie cardiovascolari diminuite del 50-60%, per il cancro incidenza/mortalità sostanzialmente
invariate con piccole differenze da 1970 (John Bailar III). Vari modelli per carcinogenesi basati su pool di staminali che si
riproducono frequentemente (1/ 3 days), 30.000 giorni / vita media = circa 10.000 divisioni/vita individuo. Modello LuriaDelbruck 104 divisioni = 1 cellula su 100 ha mutazione in un gene qualunque (frequenza mutazioni = 10-6 /gene). Per abbattere,
questo alto valore di mutazioni in staminali,
Teoria di Cairns prevede almeno due livelli di cellule pluripotenti: N ed S. N son definite come Nsc (=Non-differentiating Stem
Cells) ed S come Spd (=Staminal Pluripotent Differentiating). Il valore di N-finale è determinato dal numero di divisioni S,
quindi N-finale = N/S. Ed il valore totale di divisioni viene dato da N/S x S. Questo perché le cellule Ncs (=N/S) effettuano
4
divisioni asimmetriche che danno come prodotto una nuova cellula Nsc identica alla precedente ed una cellula Spd che andrà
invece incontro a differenziamento e morte programmata. Con questo modello, il numero totale di divisioni viene abbattuto da
circa 10.000 a 100 nell’uomo e da circa 2.000 a 60 nel topo.
Saymour Benzer: struttura molecolare del gene “ultra-fine”. Test di ricombinazione dei geni r/h in T2. La regione rII del fago
T4: sua analisi ultramicroscopica per ricombinazione e per complementazione. Chiarimenti su modello gene di Saymour Benzer:
inversione simmetrica dei marcatori e sua spiegazione e piastramento dopo complementazione. Concetti di test cis/trans e di
Hot-Spots. Articolo Scientific American di Saymour Benzer. Gli esordi della genetica batterica: la coniugazione (Joshua ed
Ester Lederberg).
4° lezione: Venerdì 29 FEBBRAIO 2013.
REGISTRO: 1. Carisma di F. Jacob e J. Monod. Premesse al modello LAC. Felix D’Herelle; Eli Wolman e l’”indution
erotique”. 2.
L’esperimento PA.JA.MO e la sua interpretazione. Leo Szilard, operon Trp e la regolazione negativa.
3. Mutanti Operon LAC. Funzionalità dei Merozigoti per Oc; I-; Is; I-d.
DETTAGLIATO: Gli esordi della genetica batterica: la coniugazione (Joshua ed Ester Lederberg): premessa per la mappatura
genica nei batteri (Ely Wolman e Francois Jacob, i.e. coitus interruptus). Modello operone LAC di A. Lwoff, J. Monod e F. Jacob
(1960). Concetto di DIAUXIA.
Concetto di induzione (batteri, fagi) e di coniugazione (E. Wolman). Allosteria e modello LAC. Introduzione al modello LAC
(Istitut Pasteur): ipotesi/modelli iniziali del precursore pz e del plasmagene. E loro confutazione dagli esperimenti di Chr.
Anfinsen e del Biostat (AM Torriani insieme a J. Monod). Allosteria e modello LAC. Influenza Leo Szilard, e modello triptofano.
Carisma J. Monod e F. Jacob: L’hazard et la necessitè - La logique du vivant – The Statue Within. Impegno civile-culturale:
resistenza ai Nazi-Fascisti (FJ e JM) nel Fronte di Liberazione (De Gaulle) e nel Partito Comunista; critica allo Stalinismo e al
Lysenkismo. Esperimento PA.JA.MO e sua interpretazione.
5
Influenza Leo Szilard, suo contributo alla fisica e discussione etica, Bertrand Russel, Russel-Einstein Manifesto, Meeting del
Pugwash. Suo contributo a modello triptofano. Carisma insieme a J. Monod e F. Jacob: Sistemi policistronici.
André Lwoff e l’indution erotique, anche in questo caso una forte asimmetria nel risultato.
Esperimento PA.JA.MO e sua
interpretazione: Hfr (I-; z-) x F- (I+; z+) ipotesi iniziale di un regolatore interno (attivatore positivo) viene falsificata
dall’esperimento speculare: Hfr (I+; z+) x F- (I-; z-) in cui I- appare recessivo. Sistemi policistronici.
Esperimenti chiave modello LAC: mutanti Oc; I-; Is; I-d. Struttura tridimensionale del repressore e sua associazione con
mutazioni. Test cis-trans delle mutazioni LAC mediante merozigosi. Riepilogo modello e mutazioni LAC. Modello di attenuazione
nell’operone triptofano (Yanofsky). Modelli di allosteria (conformazione tesa, aggiustamento indotto) e di alterazione covalente.
Importanza modello Operon LAC per ipotizzare RNA messaggero. Esperimenti che hanno dimostrato esistenza mRNA.
Riepilogo modello e mutazioni LAC. Modello di attenuazione nell’operone triptofano (Yanofsky). Isolamento e studi su
repressori (l e Lac) da parte dei gruppi di Marc Ptashne e di Walter Gilbert. Modello tridimensionale del repressore Lac: sua
associazione a mutazioni specifiche: I-, I-S; I-D . Modelli di allosteria (conformazione tesa, aggiustamento indotto) e di
alterazione covalente. Anse sul DNA permettono interazione fra repressori a distanza. Regolazione positiva di LAC: proteina
CAP-CRP, messaggeri 2ari, regolazione da glucosio, cAMP e adenilato ciclasi, variazioni conformazionali della doppia elica.
Regolazione positiva spiega osservazioni iniziali di Monod su la “diauxia”. Regolazione complessa e coordinata fra elementi + e -.
Peculiarità operon Lac (mancanza sito UP).
5° lezione: Venerdì 03 MARZO 2013. Pochi presenti (week-end sugli sci).
REGISTRO: 1. Discussione su modelli biologici: Popper/ Kuhn/ Dogma Centrale BM. 2.
Test
su
Operon
LAC.
Ulteriori modelli nei procarioti: NTRs; ARA-BAD, Merc-T/R. Scoperta RNA messaggero. 3.
Esperimenti
di
S.
Brenner & F. Jacob, di F. Grow & J. Watson e di R. Hall & S. Spiegelman. Devianze della Genetica Medica ‘8-‘900.
6
DETTAGLIATO: Basi epistemologiche seguendo i principi di falsificabilità di Karl Popper non dimostrano grandi novità
concettuali. Un’interpretazione più consona proviene dal lavoro di Thomas Kuhn su le rivoluzioni scientifiche, quando cioè si
accumulano contraddizioni nella teoria che va per la maggiore. Esempi potrebbero essere la meccanica Galileana che sostituirà nella fisica- la visione Aristotelica, ovvero la Teoria Relativistaica di Einstein che andrà a modificare la meccanica Newtoniana.
Secondo la visione di Gunther Stent questa fase corrisponderebbe probabilmente a quella “accademica” della Biologi Molecolare.
Risposta SOS: attivazione RecA, Inattivazione LexA, ESERCITAZIONE IN CLASSE su regolazione gene ALT-1 da glucosio e
zucchero raro da dvd testo Watson JE: Molecular Biology of the Gene.
Elementi generali su trascrizione: RNA polimerasi, Sequenza -10, -35, UP, e -10 extended. Tecniche del foot-printing e del
gel-shift. Subunità sigma. Importanza delle sub-regioni (4.2, 3.0, 2.4, 2.3 etc.), dei 5 canali di accesso all’enzima e del’ alfa-CTD.
Ruolo della sigma 1.1 e 3.1 – omologie con DNA. Complesso promotore chiuso ed aperto, promoter-escape. Concetti più generali di
attivatori e repressori, regolazione per regulated recruitment e da repressore.
Importanza del modello Operon LAC ed in particolare dell’esperimebto PA.JA.MO per ipotizzare RNA messaggero.
Falsificazione modello (1 gene-à1 ribosome --à 1 protein. Esperimenti che hanno dimostrato esistenza mRNA: di Brenner-Jacob
(isotopi pesanti e radiattivi) marcando sia con C14 (pesante) che con S35 (radioattivo) e di F. Gros-J. Watson (batteriofago).
Esperimento di S. Spiegelman e R. Hall dimostra presenza mRNAs per ibridazione dopo aver marcato con P32 e con timidina
tritiata.
Regolatori essenziali: Attivatori, Repressori, Elementi che bloccano complesso repressore chiuso, Siti legame sul DNA,
tecniche di Southern Blotting, Northern Blotting e di Foot-Printing. Esperimenti swapping CTD, struttura del promotore “nonideale”. Espressione genica: repressa, livello basale, elevata.. Importanza sub unità Sigma (70, 28,34). Modificazioni polimerasi
(glnA, NTR-C). Variazione conformazionale DNA promotore (gene Mer-T e regione Mer-R).
EUGENETICA: Aspetti Generali. Dibattito su mutazioni casuali vs. mutazioni adattative: le tristi conseguenze dell’ideologia
eugenetica: Charles Davenport, Harry Laughlin e l’Eugenics Record Office a Cold Spring Harbor, NY. L’interessante caso del 1°
Ammiraglio della Flotta USA, David Farragut (“damn the torpedoes: full speed ahead !”) considerato da Davenport nel suo
classico testo: “Naval Officers: their Heredity and their Development”. Discussione su ereditarietà, nature e nurture.
7
6° lezione: Venerdì 15 Marzo 2013. (qualche assente).
REGISTRO: 1. Ripasso regolazione procarioti. Geni ARA-BAD + C. Isolamento repressori LAC (Walter Gilbert & Benno
Muller-Hill) e LAMBDA (Mark Ptashne) 2. Legame DNA e attivazione Gal-1/Gal-4. Attivazione Lex-A. Two Hybrid
System. Introduzione a Organizzatore di H. Speman.
3.
Meccanismi di Embriogenesi Molecolare: Spaetzle
Toll Cactus
Dorsal. TWIST/ RHOMBOID/ SOG. Hazard et Necessité di J. Monod.
DETTAGLIATO: Modello operon arabinosio. Ara-BAD e regolazione da AraC, ma anche da CAP/CRP. Southern Blotting,
Northern Blotting, Western Blotting, Footprinting Technology.
Esperimenti di Mark Ptashne per isolare il repressore di lambda. Regione di immunità del batteriofago 434 ovvero di Lambda.
Mutanti virulent simili ad Oc, concetto di l-immunity. Esperimenti di isolamento del repressore Lac con IPTG marcato del gruppo
Gilbert/Mueller-Hill.
Ripetizione esperimento PA.JA.MO e sua interpretazione. Influenza Leo Szilard, suo contributo alla fisica e discussione etica,
Bertrand Russel, Russel-Einstein Manifesto, Meeting del Pugwash. Suo contributo a modello triptofano. Carisma J. Monod e F.
Jacob: Sistemi policistronici.
Attivazione negli Eucarioti:
Mark Ptashne decide di studiare questi meccanismi in lievito. Gene Gal1 viene regolato da
attivatore Gal4 che ha due funzioni: 1. legame a sito DNA a monte (UAS: (AA 1-147)); 2. attivazione trascrizione del gene Gal1
stesso (AA 148-881). Esperimenti di “swapping” con repressore Lex-A (procariotico, con suo specifico sito riconoscimento su
DNA) e di “chimerismo artificiale”(LexA-Gal4). Meccanismo di REGULATED RECRUITMENT . Meccanismo generale che
ritroviamo anche nel STP (signal transduction pathway) esemplificato da Joseph Merrick = Elephant Man: alterazione di STP nel
gene GAP (ras pathway, NF-1).
Two Hybrid System:
Modello dimostrato inizialmente da Ptashne, che richiede almeno due elementi per attivare la
trascrizione (UAS binding e attivazione stessa). Vengono nuovamente riassunti qui di seguito. Attività HAT (acetilasi) e attività
HDAC (deacetilasi). Esperimenti di Mark Ptashne per studiare la regolazione negli eucarioti (lievito). Scoperta di L. Guariente
del sito UAS, regolatore CYC1. Funzione Lex-A nei procarioti: ripasso azione di RecA nell’induzione della lisogenia. Adattamento
Lex-A eucarioti e sua inibizione in modello Gal1-Gal4. Costruzione molecola ibrida Lex-A/Gal-4 e sua funzionalità in un saggio su
8
Gal-1. Essenzialità sito Lex-A sul DNA. Modello di localizzazione o di reclutamento regolato (regulated recruitment).
Associazione con meccanismi di Trasduzione del Segnale (Signal Transduction Pathway, STP). Determinazioni associazioni fra
proteine mediante two hybrid system: fish, bait e selezione con auxotrofi. Modello sperimentale: sistema 2 ibridi (2 hybrids
system). Schema generale Aux-Trp; Aux-Leu; Aux-His e selezione per plasmidi contenenti Bait, Fish (generalmente genoteca
cDNA), ultima selezione per prototrofia His. + Dettagliato: Su questi stessi principi si basa il sistema 2 Ibridi: le due
funzioni di 1. legame all’UAS e di 2. attivatore trascrizione vengono separate nei due diversi domini. Se e solo se i due domini si
RIASSOCIANO (i.e. si legano l’una all’altra), allora avremo attivazione finale. Elemento “FISH” (pesce, preda) e “BAIT” (esca).
Esempio con RAS, del quale cerchiamo i gigandi successivi (nel STP), diviene il BAIT. Non sapendo quale fish abboccherà,
produciamo una genoteca di espressione (FISH) che produca TUTTI gli mRNA presenti nella cellula (cDNA library). Utilizzando
un triplice auxotrofo: trp/leu/his, il BAIT viene introdotto con vettore trp+, la genoteca cDNA cone vettore leu+ ed infine si
testa l’avvenuta associazione per prototrofismo per il gene his (his+).
Biologia Molecolare Embriogenesi-- Introduzione Dibattito su preformismo (Homunculus) ed epigenesi (entelechia di
Aristotele; esprit vital successivo) caratterizza molti studi embriologici fino al secolo scorso. Roux riuscì ad inattivare con un
ago arroventato una delle due cellule dello zigote di rana, ottenendo uno sviluppo parziale (preformismo). Tuttavia esperimenti
simili effettuati sul riccio di mare (in fase di blastula) da Driesch e da Morgan ancora su rana ottennero risultati opposti:
ciascuna delle cellule separate di un embrione primordiale può ricostruire l’intero embrione (epigenesi). Simili risultati con
idre/polipi. Esperimenti di Hans Speman. L’esperimento di Hans Speman è stato fondamentale per la nostra comprensione
dell’embriogenesi e per la caratterizzazione dell’organizzatore embrionale. Verrà premiato con il Nobel . Preliminari: Speman
dimstrò che una costrizione dell’embrione di Drosophila (ottenuta con un capello della sua neaonata Gretchen) bloccava la
formazione di strutture centrali quali ali e altere. Consiste nel trapianto del blastoporo dorsale (blastula/gastrula) in una
posizione ectopica su di un altro embrione (eseguito su specie di Salamandre, distinguibili per maculazioni/diverso colore della
pelle). H. Speman e H. Mangold riuscirono ad indurre dal sito del trapianto la generazione di un “gemello siamese”. L’appropriato
utilizzo di specie variate e distinguibili permise di capire che era dovuto alla presenza di un “ORGANIZER” (sostanza
diffusibile, morfogeno) e non di “crescita ed embriogenesi delle cellule trapiantate”. La natura molecolare dell’ “ORGANIZER”
verrà considerata nella prossima sezione.
Meccanismi molecolari dello sviluppo. Principi fondamentali evoluzione darwiniana (600 mil. anni) e separazione protostomideuterostomi. Assi antero-posteriore e dorso-ventrale. 13a divisione: circa 6000 cellule corticali + 2000 che formano il
9
vitellogeno. Porzione posterioreà granuli polari, cell. Polari estroflesse.
3 principi essenziali x studiare sviluppo;
1.
gradienti: si evincono sin da esperimento pioneristico di Speman e sono bene evidenziabili con tecniche di Northern e IHC
(esempio: fattore bicoid); 2. trasporto: vi sono vari esempi di morfogeni/fattori di crescita che vengono trasportati –spesso a
livello del messenger RNA (mRNA). Esempio principale: endonucleasi HO viene espressa nel sistema di sessualità lievito –
caratteri a ed a- solamente nella cellula genitrice grazie ad un rinibitore ash il cui mRNA viene trasportato nella cellula figlia.
Simili sistemi per OSKAR, trasportato al polo posteriore grazie a sequenze riconoscimento nell’mRNA di Oskar situate nella
regione 3’-UTR. Se scambiamo (swapping) questa regione 3’-UTR di Oskar con la corrispondente regione del gene Bicoid
(materno, posizionato anteriormente), si creeranno embrioni con due estremità posteriori (polar cells anteriori). 3. rescue :
tipici esperimenti di rescue sono quelli nei quali una determinata mutazione viene “complementata” dall’aggiunta di
sostanze/estratti ottenuti da embrione WT.
Gradiente dorso-ventrale. Presente sia in insetti che in vertebrati, ma nei primi appare essere invertito, probabilmente in una
biforcazione primordiale dell’evoluzione. Effettori; Gurken, Torpedo, RAS (funzione principale: inibire Spaetzle). Attivazione
STP di Toll-receptor (also immunity), similarità con rel, NFkB e IkB (dorsal/cactus) e con NIK/IRAK (pelle/tube). Su lato
dorsale, è attivo invece il gradiente di BMPs (bone morphogenic protein) che a loro volta attivano i segnalatori Smad’s. Dorsal
però non viene eliminato: sempre presente nell’embrione, viene traslocato nel nucleo solo dopo attivazione da Spaetzle
(esperimenti IHC). Trasmissione segnale regione ventrale (mesenchima)-à neoroectoderma laterale : TWIST - ROMBOID –
SOG . Dipendenza da segnale molecolare (enhancers). Twist ha un numero limitato di siti binding per Dorsal: verrà quindi
attivato solo in posizione ventrale, dove Spaetzle ha più alta concentrazione. Ulteriore regolazione da SNAILS, inibitore a sua
volta attivato da TWIST e DORSAL solo ventralmente.
7° lezione: Venerdì 22 MARZO 2013.
REGISTRO: 1. Hazard et Necesité di J. Monod. Meccanismi di allosteria e Feed-Back. Cenni di Evoluzionistica: The
Spandrels of St. Mark by Stephen J. Gould e R. Lewontin. 2. Origine della Vita.
Esperimento di Miller-Urey.
Modelli di biogenesi sulla terra secondo Martin e Russel
3. Riboswitches. Ribozimi: Thomas Chek e Sidney Altman.
Sol Spiegelman e “the little monster”. Dettagli finali embrionegensi: Even-Skipped 2.
10
DETTAGLIATO:
Embriogenesi molecolare: Gradiente terminale posteriore. Torso dimostra un peculiare sistema
STP: -P in Y-918 implica legame di GAP e previene attivazione RAS (Von Reclinghausen o NF-1). In caso di attivazione
recettoriale, -P anche in Y-630, la proteina legata, CORKSCREW, è una fosfatasi che quindi defosforila Y918, allontana GAP e
permette
attivazione
RAS.
Geni di Segmentazione (Asse Antero-Posteriore). Studiati soprattutto da C. Nusslein-Vohlard ed E. Wieschous includono sia
GENI MATERNI (presenti già nell’uovo ma variamente attivati/regolati): due esempi che abbiamo già in parte visto sono Bicoid
ed Oskar. Oskar posizionato per trasporto mRNA (esemplificato da feromoni/sessualità lievito: gene HO viene esptresso solo
nella “mother cell” perché l’inibitore ash1 viene trasportato ed espresso specificamente ella cellula figlia). Spesso i geni materni
regolano la famiglia successiva di geni: GENI GAP. Così, nel caso di Bicoid (materno), due geni vengono regolati dal suo
gradiente: Orthodenticle e Hunchback (Hunchback è in realtà a metà strada fra materno e GAP precoce, vedi oltre).
GENI GAP Orthodenticle viene espresso solo in posizione più anteriore rispetto ad hunchback, in quanto possiede un minor
numero di siti di legame/enhancers per l’attivatore Bicoid. Il gradiente di Bicoid e l’affinità dei siti di legame determinano
quindi il pattern per questi geni GAP. Come accennato, Hunchback ha anche una componente “materna” in quanto una copia di
questo gene viene regolata come materna. Viene tuttavia antagonizzata nella sua espressione finale (sintesi proteica) dal
regolatore NANOS, che si lega al 3’-UTR e che a sua volta viene espresso caudalmente. Il gradiente di Nanos può essere
dimostrato con IHC ed ibridazione in situ. Altri tre geni GAP vengono similmente regolati da Hunchback (tipo GAP precoce):
Kruppel, Knirps e Giant vengono espressi in quest’ordine su asse A-P, in quanto Hunchback è in questo caso regolatore negativo
(repressore): Giant sarà espresso in posizione + caudale, laddove Hunchback è in minor concentrazione in questo gradiente, in
quanto il suo enhancer contine un numero di siti di legame assai più elevato rispetto a Kruppel (7 vs 3), etc.
GENI del PAIR-RULE Geni del Pair-Rule sono tipicamente regolati dai geni del GAP, espressi più precocemente nell’ontogenesi.
Qui l’espressione è ancor più sofisticata, in quanto specifici geni verranno regolati in specici segmenti genici. Se analizziamo il
gene Pair-Rule chiamato Even Skipped (Eve), ci accorgiamo che la sua espressione in segmenti specifici è determinata dalle
sequenze regolative che si trovano a monte o valle del gene. Legando queste sequenze a b-Gal (Lac-Z), l’enzima verrà espresso in
maniera specifica nelle varie bande. A fronte di un gene di appena 1.5-2 kb, le sequenze regolative occupano circa 12 kb. Ad
esempio, nel 2° segmento EvenSkipped viene specificamente espresso, quando sono assenti gli inibitori Kruppel e Giant (Geni
GAP; che determinano quindi l’inizio e la fine della striscia di espressione) e quando sono al contempo presenti gli attivatori
Bicoid e Hunchback (attivatore in questo caso). La natura di questi regolatori viene confermata in animali transgenici KO per
questi fattori: mentre i KO di Kruppel e Giant espandono molto la striscia EvenSkipped-2, il KO di Hunchback ne è privo.
11
Talvolta, repressori da soli possono determinare il posizionamento delle singole bande/segmenti: sempre per EvenSkipped, le
bande 3 e 4 sarebbero determinate dai gradienti di Hunchback e Knirps che sono opposti (i.e., A-P e P-A): gli enhancers in
stripe 3 hanno pochi siti per Hunchback e di + per Knirps (3 e 5), mentre la situazione in stripe 4 è speculare (6 e 3). Sia
Hunchback che Knirps agiscono qui come inibitori dei segmenti 3 e 4.
GENI del SEGMENT-POLARITY. Per questi geni, in particolare per Goosberry e per Paired, conosciamo degli interessanti
meccanismi evolutivi. Questi sono i geni che determinano la porzione Anteriore o Posteriore di ciascun segmento. Nel caso di
Goosberry e di Paired, la loro sequenza dimsotra la presenza di due importanti domini regolativi: PAX (da paired) e Homeobox.
Anche se i due regolatori Goosberry e Paired dimostrano soltanto 25% in omologia di sequenza (a livello di aminoacidi), i due
elementi regolativi, PAX e HMBX sono presenti in ambedue in posizioni equivalenti. Mutanti Goosberry dimostrano alterazioni in
ciascuno dei 14 segmenti di DM, mentre quelle Paired in segmenti alterni (7 su 14). Per rispondere alla domanda se la sequenza
Paired sia derivata per duplicazione di Goosberry (come appare assai probabile) e soprattutto se siano essenziali per lo sviluppo
le variazioni (mutazioni) introdotte in Paired, ovvero le sequenze regolative, è stato effettuato il seguente esperimento. Un
mutante Goosberry dimostra un pattern scomposto nei 14 segmenti: questo mutante viene reso transgenico con l’aggiunta di una
fusione fra il gene Paired (25% omologo) e le sequenze regolative di Goosberry. Il moscerino transgenico diviene perfettamente
funzionale/WT (RESCUE), dimostrando così che è l’espressione di Paired sotto controllo di tipo Goosberry che permette il
recupero (o complementazione).
8a lezione: Venerdì 4 APRILE 2013.
REGISTRO: 1. Principi essenziali della Replicazione. Problema tautomerizzazione. Fedeltà re plicativa 10-5
10-7
(proofreading)
10-9 (MMR).
2. Meccanismi Mutazione: agenti alchilanti, ossidanti (ROS), deaminanti etc.
Specificità MMR per elica neo-sisntetizzata (GATC, Dam metilasi). Carrellata: dalla scoperta dei carcinogeni ai
mutageni agli oncogeni umani: P. Pott K. Yamagiwa
H. Kenneway
B. Ames
Wigler-Cooper-Barbacid-Weinberg.
3.
Meccanismi del riparo del DNA. 1. fotoliasi, 2. demetilasi, 3. ER: BER e NER: GG e TCR. UVR-ABC.
DETTAGLIATO: Caratteristiche essenziali replicazione (dNTP)n + dNTP (dNTP)n+1 + P-P. ∆G da sfavorevole (3.5
Kcal/mole) a favorevole (7kcal/mole) con pirofosfatasi (implicazioni per piro-sequenziamento). Riconoscimento appaiamento
basi, discriminazione fra desossi- e – ribonucleotidi, paragone con struttura mano destra: palmo, dita e pollice. Primer, curva 90°
12
C e suo ruolo, funzione di thumb, palm e fingers, ruolo Mg++ e Zn++ su due siti aminoacidici A e B, ruolo Tyr su elica O, Lys e Arg
neutralizzano su fingers. Concetto di processività ed esemplificazioni (pol I e pol III).
MUTAZIONI: Necessità di sue ciclo per stabilizzarla. Due tipi: transizioni e transversioni. Meccanismo tautomerico già
menzionato nel lavoro del ’53 (Donahoo). Altri analoghi: BrdU, acyclovir etc. Proofreading etc da 10-5 a 10-7 mut.rate- 10-10
grazie a MMR. MutS, MutH, MutL, seguiti da Exo7 o RecJ + Exo1/Exo6, meccanismo molecolare della riparazione per scelta di
elica (metilasi DAM e GATC). Meccanismi mutageni endogeni (formazione ROS, alchilazione, ossidazione, deaminazione etc.) ed
esogeni – radiazioni UV e iuonizzanti, raggi X etc. (Hoeijmakers). Ripetizione su analoghi basi: strutture chetoniche ed enoliche,
BrdU, acyclovir etc. Deaminazione Citosina non da forte rischio, se metilata porta ad una transizione. La maggior parte siti C è
eliminata nel genoma ad eccezione di CpG islands, importante per controllo geni (soratutto housekeeping). Le CpG islands sono
marcatori della presenza di geni. Formazione anelli ciclobutanici, soprattutto da rad UV: dovuti a stacking (TT o TC o CC).
Danno da sostanze intercalanti: Acridine Orange usato indiscriminatamente come defoliante spesso associato a diossina (studi
IARC, movie Platoon): carcino- e teratogenesi, forte aumento di still births. Altri intercalanti (EthBr, ProEth).
Carrellata su Mutagenesi
Oncogeni.
Test di Bruce Ames dimostra forte associazione fra carcinogenesi e mutazioni.
Panoramica carcinogenesi: Katsosaburo Yamagiva dimostra per la prima volta l’induzione di tumori con carcinogeni (catrame).
Ernest Kennaway riesce ad isolare da tonnellate di catrame il BenzoPirene, MetilColantrene, DimetilSolfato etc., primi
carcinogeni puri. Su queste sostanze si basa test di Ames: utilizza mutanti auxotrofi His- di Salmonella Tiphimurium,
studiandone reversione inducibile a His+. Carcinogeni devono essere precedentemente attivati (in genere da geni detossificanti,
ad esempio da Citocromi P450). Esemplificazioni con EthylMethanSulfonato, UV e Aflatoxin B. Ciascun ceppo appare specifico
per un certo spettro di mutazioni ma non per altre. Gli ultimi studi in questa panoramica, sono quelli eseguiti per chiarire il
meccanismo di alcuni tumori umani: Joseph Merrick –the elephant man- è un esempio paradigmatico di mutazioni in questo
pathway: breve sketch del personaggio affetto da malattia di Von Recklinghouse ovvero Neurofibromatosi 1 (NF1). Il pathway
NF1 si associa tramite il Signal Transduction Pathway (STP) a RAS (simile a G-binding proteins) ed è stato evidenziato da una
serie di studi eseguiti contemporaneamente da Geoffrey Cooper, Robert Weinberg, Mariano Barbacid e Mike Wigler.
Identificazione di oncogeni con tecniche di trasfezione in cellule di topo NIH-3T3 (Robert Weinberg, Mariano Barbacid,
Michael Wigler, Jeffrey Cooper): identificazione iniziale e purificazione delle sequenze umane con sonde Alu. Ulteriori passaggi
per trasfezione (2aria, 3aria). Clonazione in vettore lambda e caratterizzazione con sonde v-onc.s. Omologia con v-ras,
13
identificazione mutazione puntiforme mediante tecniche taglia-cuci ed infine con sequenziamento. Ruolo della mutazione
attivante ras: inattivazione GTPase.
Simili alterazioni nella malattia di Von Recklinghausen/Neurofibromatosi I (gene Gap).
Studio di carcinomi alla vescica, frequente nei fumatori, utilizzando la tecnica della trasfezione su cellule murine NIH-3T3 per
riuscire ad isolare il gene (su circa 23000) affetto. Per le cellule trasfettate, vengono utilizzate in esperimenti di Southern
blotting sequenze ripetute di tipo Alu (circa 106/nel genoma umano, sequenze cosiddette SINE): nelle prime cellule trasfettate
sono presenti molte bande Alu, che però diminuiscono nelle trasfezioni successive (perché ?). Ulteriori sonde per oncogeni
umani non dimostrano alterazioni ad eccezione del gene RAS. Per capire però cosa era stato alterato in RAS, sia Weinberg che
Barbacid eseguirono una serie di esperimenti di “taglia&cuci” in cui univano insieme diverse porzioni del gene RAS normale e di
quello ottenuto dai tumori alla vescica. Con questa tecnica, localizzarono la mutazione in una regione all’estremità 5’ del gene
RAS e successivi esperimenti di sequenziamento dimostrarono la presenza di mutazioni in posizione 12-13 o 59-60.
Meccanismi di riparo: fotoliasi attivata da quanti di luce visibile. Ulteriori meccanismi: ER, BER, NER (GG-NER e TCR-BER);
MMR; HR e NHEJ.
Metiltranferasi permette una reversione immediata del danno, ma con meccanismo assai dispendioso per la cellula (enzima viene
inattivato).
Glicosilasi scindono legame glicosidico creando sito AP (apurinico/pirimidinico). Meccanismo di flipping-out della base male
appaiata. Glicosilasi per Uracile, oxoG, metilG etc. Meccanismi ER (excission repair): 1. short patch ER: Nuclease APE agisce
successivamente e taglia zucchero-fosfato del sito AP seguita da nucleasi/ligasi XRCC1 (X-rays cross-complementing) e ligasi 3
e da polimerasi β. 2. long patch ER: intervengono PARP (poly-ADP ribose polymerase) e PNK (Poly Nucleotide Kinase), le
cosiddette sliding clamps (pinze scorrevoli) FEN1 =Flap Endonuclese, DNA ligasi XRCC1 e ligasi1.
Importanza MGMT nella terapia dei gliomi (presentazione lavoro M. Hegi su NEJM: temozolomide –agente alchilante- agisce
solo su pazienti con MGMT metilato –discussione). Ulteriori meccanismi di fail-safe, glicosidasi che riescono ad eliminare base
alterata: MutT elimina oxoG, mentre MutY elimina basi appaiate incorrettamente con oxoG.
MMR: geni equivalenti negli eucarioti: MSH (MutS homologue), MLH (MutL homologue) e PMS.
BER e NER, caratteristiche generali che li distinguono si basano sulle dimensioni degli addotti riparati dai due meccanismi.
James Cleaver e lo studio di mutazioni nello Xeroderma Pigmentosum (anomalie sistema nervoso e forte aumento tumori)- geni
XP, Cockayne Syndrome e geni CS.
Sistema UVR-ABC: AB riconoscono e segnalano danno, mentre C esegue incisione su doppia elica.
14
9° lezione : VENERDI’ 12 APRILE 2013.
REGISTRO: 1. Ripetizione BER, NER, MMR. Sindromi associate: HNPCC, XP, Cockayne.
2.
NER:
GC
e
TCR:
Ripetizione apparato Basale della Trascrizione: TFIID, B, F, H. TAFs e TBP. Introduzione a fattori trascrizione.
Eptameri ripetuti su RNA pol devono essere fosforilati (TFIIH) 3. TFs:
HTH, ZN Fingers, Leu Zippers, bHLH.
Animazione su Leland Hartwell e gene checkpoints: RAd9 e Ced9. Introduzione alla Ricombinazione: Esperimento di
Creighton-McClintock. Esperimenti di Meselson-Weigle dimostrano ricombinazione per “breakage-reunion”. Modelli di
Holliday (2 SSBs e 1DSB).
CONCLUSIONE RIPAREO ER. NER si distingue in NER-GG (global genome) e NER-TCC (transcription coupled repair).
DETTAGLIATO: Elementi essenziali RNA pol (procarioti). Promotori deficitari/deboli (-35 BP element; extended promoter,
etc.). Corrispondenza con sub-regioni 4.2 e 3.0/2.4. di sigma Varie sub-regioni assolvono funzioni differenti. La 4 implicata nel
riconoscimento e la 2 nella dissociazione delle basi (à complesso aperto). 5 canali di entrata/uscita: ingresso DNA, uscita elica
T, uscita elica NT (stampo/non stampo), uscita dell’RNA e canale (ortogonale) per ingresso nucleotidi. s 1.1 importante
regolatore dell’ingresso del DNA., in quanto mimica il DNA stesso e blocca così l’enzima. s 3.2 mimica invece l’RNA e fa quindi
scivolar via i neotrascritti, causando così trascrizione abortiva.
Elementi essenziali della trascrizione negli Eucarioti: 3 RNA polimerasi principali negli euc.: la pol-II trascrive geni cellulari.
BRE o elemento di risposta a TFIIB (TFIIB response element), TATA associato a TBP (TATA box binding protein), Inr
(iniziatore) e DPE (downstream promoter element) che legano il TFIID, forse il primo fattore di trascrizione “essenziale” per
inizio (molto grande, 8-9 elementi): è un complesso multi proteico = contiene infatti sia il TBP (TATA box binding protein) che i
TAFs (TBP associated factors). Alcuni TAFs hanno una struttura che ricorda gli istoni, ad esempio TAF 42 e 62 di Drosophila
sono simili a H3-H4, mentre altri TAF mimetizzano il DNA, ad esempio nel caso in cui legano la porzione di TBP che legherebbe
normalmente la doppia elica come per s 1.1 ). TFIID attiva trascrizione creando una drammatica curvatura nel DNA di circa
100°, interagendo con il solco minore. Al legame di TFIID segue quello di TFIIA e TFIIB (simile a sigma 3.2), dopo di che la
polimeasi (Pol II) può legarsi al sito promotore in associazione a TFIIF. Complesso di “pre-inizio” della trascrizione. Qui le cose
15
si complicano negli eucarioti, nel senso che la polimerasi deve a sua volta associarsi ad una regolazione raffinata per agire: dopo
il legame con TFIIE, interviene TFIIH, un complesso multi proteico dotato di attività ATPasica, elicasica ed anche chinasica.
ATP viene scisso nel passaggio da complesso promotore chiuso ad aperto (melting dsDNA + attività elicasica) mentre l’attività
chinasica è essenziale per fosforilare residui tirosina sulla “lunga coda” presente sulla PolII. Sequenza ripetuta
TyrSerProTyrSerProSer di 7AA ripetuti 30 volte nel lievito e 52 volte nell’uomo deve essere fosforilata in Tyr dalla chinasi
presente nel complesso TFIIH perché avvenga il cosiddetto “promoter escape”. Ultime considerazioni: la funzione di traitd’union fra DBD e attivatore (Ptashne) viene svolta negli eucarioti superiori dal Mediatore, un altro complesso multi proteico
(almeno 20), spesso associato ad elementi SAGA o SWI5, cioè rimodella tori della cromatina. Il Mediatore corrisponde quindi al
modello dimostrato inizialmente da Ptashne, che richiede almeno due elementi per attivare la trascrizione (UAS binding e
attivazione stessa). Vengono nuovamente riassunti qui di seguito. Attività HAT (acetilasi) e attività HDAC (deacetilasi).
Esperimenti di Mark Ptashne per studiare la regolazione negli eucarioti (lievito). Scoperta di L. Guariente del sito UAS,
regolatore CYC1. Funzione Lex-A nei procarioti: ripasso azione di RecA nell’induzione della lisogenia. Adattamento Lex-A
eucarioti e sua inibizione in modello Gal1-Gal4. Costruzione molecola ibrida Lex-A/Gal-4 e sua funzionalità in un saggio su Gal-1.
Essenzialità sito Lex-A sul DNA. Modello di localizzazione o di reclutamento regolato (regulated recruitment). Associazione con
meccanismi di Trasduzione del Segnale (Signal Transduction Pathway, STP). Determinazioni associazioni fra proteine mediante
two hybrid system: fish, bait e selezione con auxotrofi. Modello sperimentale: sistema 2 ibridi (2 hybrids system). Schema
generale Aux-Trp; Aux-Leu; Aux-His e selezione per plasmidi contenenti Bait, Fish (generalmente genoteca cDNA), ultima
selezione per prototrofia His.
Introduzione alla ricombinazione: esperimento seminale di McClintock-Creighton: utilizzazione oltre ai marcatori genetici (wx
e c), di 2 marcatori citologici (knob ed interchange). Figura carismatica della B. McClintock: sue peregrinazioni fino agli studi a
CSHL. Esperimenti di M. Rhoads (A1a1/Dtdt = selfing o autoimpollinazione) e B. McClintock (CDs/CDs; Ac/Ac+ x cDs+/cDs+;
Ac+/Ac+) : sua spiegazione molecolare. Introduzione agli elementi trasponibili: paradosso della pannocchia colorless maculata.
Elementi del mais sono trasposoni: autonomi (Ac, Spm, Dt) e non-autonomi (Ds, dSpm, Unnamed). Generazione di Ds a partire da
Ac. (riquadri di Punnett, esercitazione in aula): introduzione agli elementi trasponibili, Retrotrasposoni e Retrovirus.
16
10° lezione : VENERDI’ 26 APRILE 2013.
REGISTRO: 1. La ricombinazione e la sua importanza per i meccanismi di riparo del DNA. Sintesi Translesione (TLS)
Polimerasi IV e V, κ e ξ.
ξ Varianti del Modello di Holliday: Meselson-Redding e Szostack-Orr-Weaver. 2. Stallo della
forcella, sua regressione e collasso. Apparato enzimatico Spo11 / Rec ABCD, Ruv ABC. Hereditary Non-Polyposis
Colon Cancer (HNPCC): Kolodner Vogelstein, Lynch. Meiosi. 3. Sequenze X. Meccanismi molecolari di Rec A, rec
FOR, HR/NHEJ. Grandi complessi proteici: MRN e MRX; BRCA1/BRCA2; Synthetic Lethality. Introduzione ai
trasposoni: esperimenti di Marcus Rhoades a Barbara McClintock.
DETTAGLIATO: RIPARO PER RICOMBINAZIONE: Si instaura quando vi sia un’impossibilità ad effettuare riparo ER, per
una lesione grave al DNA, tipicamente un taglio dsDNA (interruzione della doppia elica). Riparo per ricombinazione omologa
(HR): possibile quando vi sia uno stampo intatto. Esemplificato da SCE (sister chromatid Exchange). Fattori che intervengono
(definizioni e funzione): SPO-11, MRX, MRN, DMC1, RAD51 (omologo di REC-A), RAD-52, RAD-50. Alterato nella Sindrome di
BLOOM, in quella di Nijmegen ed inell’atazia telangectasia (AT). Anche nel caso di mutazioni BRCA-1 e BRCA-2 viene
chiaramente alterato un meccanismo di ricombinazione HR. Riparo per ricombinazione non-omologa (Non-Homologous End
Joyning - NHEJ):
Attivazione di KU-70 e KU-80 che mantengono uniti i frammenti di DNA non-omologhi. Attivazione con
ssDNA di DNA-PK, che fosforila e attiva Artemide (Venere), un’endo/esonucleasi
formazione frammenti 3’-OH
attivazione
rec. NH.
γ-H2AX, importante segnale di danno cromosomico trasmesso da ATM (mutated in AT) e ATR (ATM related), due sensori del
danno genotossico. Segue fosforilazione della sequenza SQEL/Y (serina-glutammina-ac. Glut- leucina/ tirosina), marcatore del
danno per 50 kb fino MegaBasi. Intervengono anche rimodellatori, tipo SWI/SNF.
17
11° lezione : Venerdì 03 MAGGIO 2013.
REGISTRO: 1. Ripetizione esperimenti di Marcus Rhoades a Barbara McClintock (analisi mediante Punnet’s square).
Scoperta sequenze IS nei batteri da parte di J. Shapiro. Ricombinazione Sito Specifica (SS): Cre e LozP. Meccanismi
“copia & incolla” e “taglia e cuci” (TN5 e TN10) 2. Meccanismi molecolari (esperimento Xgal e LINE/SINE).
Retrotrasponi. Replicazione Retrovirus (Temin e Baltimore). Sequenze LINE e SINE. Piselli di Mendel (IS gene SBEI).
3. Introduzione geni Immunoglobuline: Ehrlich, Landsteiner, Pauling, M. Burnet, N. Yerne. Esperimento S. Tonegawa.
Mecannismo molec.: esameri/nonameri/spaziatori. Calcolo specificità ottenibili. Esperimento Schatz/Baltimore RAG1/2.
DETTAGLIATO: Ripetizione esperimenti B. McClintock: Crossing-Over; BFB cycle Ac/Ds elementi trasponi bili (utilizzo
riquadro Punnet).
Scoperta trasposoni nei batteri: esperimento di Shapiro su mutanti gal-. Esperimenti mediante gradienti di densità/
microscopia elettronica.
Insertion sequenze –IS- spiegano integrazioni saltatorie. Struttura molecolare e meccanismi di integrazione. Sequenze
ripetute invertite e dirette (meccanismo originante). Trasposoni semplici e composti. Plasmidi e geni resistenza. Trasposizione
replicativa e non (esempi). Formazione dei co-integrati. Eventi molecolari distinguono i due tipi di trasposizione.
Trasposoni a DNA e retroposoni. Esperimenti che dimostrano retro-trasposizione (Lac Z+/-). Replicazione trasposoni a livello
forcella replicazione può mimare trasposizione replicativa. Sequenze aggiunte sul sito bersaglio. Dimostrazione di
Retrotrasposizione. Trasposoni eucarioti: LTR+ ed LTR-; autonomi e non-; elementi LINE (Long Interspersed Nuclear
Elements) e SINE (Short Interspersed Nuclear Elements). Esperimento: Mobilitazione di Alu da parte di SINE (introne
autocatalitico). Mutazione piselli rugosi di G. Mendel (gene SBEI). Meccanismi “taglia&cuci” (TN-10) ed esperimento che lo
dimostra (heteroduplex) e “copia&incolla” (TN-3).
Dimostrazione di Retrotrasposizione. Trasposoni eucarioti: LTR+ ed LTR-; autonomi e non-; elementi LINE (Long Interspersed
Nuclear Elements) e SINE (Short Interspersed Nuclear Elements). Esperimento: Mobilitazione di Alu da parte di SINE
(introne autocatalitico). Mutazione piselli rugosi di G. Mendel. Meccanismi “taglia&cuci” (TN-10) ed esperimento che lo dimostra
(heteroduplex) e “copia&incolla” (TN-3).
18
Importanza seq.s SINE e LINE. Seq.s SINE possono trasporsi solo in presenza di LINE: dimostrazione sperimentale =
necessità presenza di una RT attiva. Esperimento: Mobilitazione di Alu da parte di SINE (introne autocatalitico).
Introduzione a retrovirus come retrotrasposoni. Introduzione e struttura dei retrovirus (R-5’/ 3’-R) come retrotrasposoni.
Esperimenti di David Baltimore e Howard Temin (isolamento della RT), di Peter Vogt, Peter Duesberg, Hidosaburo Hanafusa
(struttura genoma virale): meccanismo di replicazione saltatoria (2 jumps). Trascrittasi ed integrasi. Provirus ed LTR (3’-R5’). Strutture di integrazione. Alta percentuale sequenze retrotransposons nei genomi dei (in)-vertebrati.
INTRODUZIONE MECCANISMI IMMUNOLOGIA MOLECOLARE.
Il problema della risposta anticorpale: studi di C. Landsteiner (apteni + carriers) dimostrano un’elevatissimo numero di
specificità Ag (circa 109). Teoria delle Catene Laterali (Side Chains): Paul Ehrlich, Esperimenti di Carl Landsteiner dimostrano
un numero quasi illimitato di specificità antigeniche 109-1010 (apten + carrier). Teorie istruttive (Felix Haurowitz, Carl
Landsteiner, Linus Pauling) e di selezione clonale (Nossal, Frank Macfarlane-Burnet, Medewar, Niels Jerne).
Teorie Istruttive falsificate dall’esperimento di Anfinsen. Approfondimento su Teoria Selezione Clonale (CST) di
Macfarlane Burnet: 1. specificità è interamente dovuta all’ospite; 2. ciascuna cellula ha una specificità unica o limitata (1 cell/1
antibody); 3. E’ l’antigene che stimola la cellula (R esterno); 4. alcune delle cellule differenzieranno in plasma-cellule. Struttura
simile a trasposoni per i geni delle immunoglobuline. L’esperimento di Sosumu Tonegawa come esemplificazione di Southern
blotting primitivo: suo significato. Struttura generale IG e TCR e loro induzione durante lo sviluppo/differenziamento: cellule,
B, T, APC, dendritiche. Struttura tridimensionali IG: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD etc. Catene H ed L, porzioni V e C, CDR I-III e
loro importanza. Calcolo possibilità combinatorie L e H e totali IgG. Ricombinazione geni Ig per delezione ovvero inversione dei
segmenti coinvolti.
Importanza sequenze di riconoscimento per riarrangiamenti: eptamero-nonamero deve essere seguito da disposizione inversa.
Ulteriore differenziamento siti riconoscimento per spaziatori 12 bp e 23 bp: anch’essi in posizione invertita.
19
Esperimento di Schatz e Baltimore per identificare i geni RAG 1 / 2.
Big-Bang evolutivo nella formazione dell’immunità
adattativa a partire da squali mascellati. Generazione di GOD per inserzione di una sequenza trasposonica all’interno dei geni
per Ig. Ulteriore diversificazione dei geni delle immunoglobuline.
Big-Bang evolutivo nella formazione dell’immunità adattativa a partire da squali mascellati. Generazione di GOD per inserzione
di una sequenza trasposonica all’interno dei geni per Ig. Implicazioni evolutive (SJ Gould, R. Lewontin “The Spandrels of St.
Marc” etc.). Implicazioni evolutive (SJ Gould, R. Lewontin “The Spandrels of St. Marc” etc.).
12° lezione : VENERDI’ 10 MAGGIO 2013.
REGISTRO: 1. Ulteriore variabilità introdotta in IgG da ricombinazione SS imperfetta. Inserzione sequenze IS a
partire da squali mascellati (creation of GOD). Ulteriore meccanismo SHM. Domanda Ndounda su HNPCC. Introduzione
all’Ingegneria Genetica: esperimento di W. Arber su restrizione/modificazione (enzimi restr.) ed animazione su Herb
Boyer e Stanley Cohen. 2. 5 steps essenziali per la clonazione. Vettori plasmi dici e non-. Clonazione cDNA: esempio
clonazione direzionale. Cloanzione con sequenze α / ο (Xgal). Bacon probes e PCR quantitativa (Q-PCR). 3.RFLPs x
mapping. Esempio Hb A/S
cut MstII/ HpaI e Medicina Darwiniana. Microarrays. Genomes (Animaz. Jim Watson +
Craig Venter)
DETTAGLIATO: INGEGNERIA GENETICA: Gli albori dell’ingegneria genetica: esperimenti di Werner Arber su
restrizione/modificazione (simili ad esperimenti di Benzer con E. coli B e E. coli K(). Modificazione spiegata da metilazione da
parte ospite. Strumenti di base: taglio con ER netti o sfalzati.
Esperimenti seminali di Stanley Cohen e Herb Boyer: generazione vettori con resistenza a Tetraciclina e Kanamicina. (da
DNAftb): creazione prima molecola chimera unendo due plasmidi, uno resistente alla Kanamycin e l’altro resistente alla
Tetracicline, creando quindi una chimera che da resistenza ad ambedue gli antibiotici. Boyer utilizzerà enzimi che creano tagli
sfalzati. Per la trasformazione, venne eseguita una tecnica con shock-termico che permette l’apertura di pori all’interno delle
membrane batteriche. Attraverso questi pori passeranno le molecole di DNA associate in precipitati con Ca++ fosfato.
Purificazione plasmidi cloruro di cesio/bromuro di etidio o cromatografia.
5 steps per la clonazione: a. estrazione/purificazione DNA; b. taglio con enzima di restrizione specifico (campione-vettore); c.
legame campione-vettore seguito da ligasi; d. selezione per cloni ricombinanti, generalmente usando come marcatori resistenze
ad antibiotici; e. selezione del gene clonato d’interesse, generalmente grazie all’ausilio di una sonda. Definizione generale di
20
vettori: plasmidici, ottenuti da fattori che conferiscono resistenza ad antibiotici (infezioni nosocomiali) e da batteriofago ,
eliminando regione di centrale di immunità. Purificazione di mRNA e sintesi di cDNA. Clonaggio cDNA in un vettore direzionale
(aggiunta di Me-dCTP e PFU). Aggiunta di sequenze adattatrici
Vettori urilizzati: plasmidi, fagi, Cosmidi, Fosmidi, YAC (fino a MBs), BAC (bacterial), PAC (P1). Clonazione del mRNA, cDNA,
selezione per code polyA. Aggiunta di piccoli adattatori. Clonaggio cDNA in un vettore direzionale (aggiunta di Me-dCTP e PFU).
Inserto verrà non solo clonato ma anche inserito in una specifica direzione. . Importanza e problemi della clonazione del primo
gene espresso: l’insulina umana (pre-pro, pro- ed insulina, animazione da Doug Hanahan, DNAftb) ottenuta inizialmente dalla
Genentech, CA. Selezione dei cloni ricombinanti con sistema LacZ (colonie blue/bianche, sub unità  e omega), escludendo
quindi quei vettori che si sono ricuciti senza inserire frammento clonabile. Clonazione cloni con batteriofago (placche- metodo
Benton-Davies). Tecniche di Southern, Northern e Western blotting (ripetizione). Importanza della probe o sonda:
esemplificazione con mio lavoro su Science (Rovigatti et al., 1986). Sonde ASO (allele specific oligonucleotides) per
caratterizzazione Sickle Cell mutation.
Introduzione alla Medicina Darwiniana (conferenza alle Baxter Lectures 2009).
Mutazione e polimorfismi per il locus
Anemia Falciforme: esercitazione in classe su mappa/diagnosi per Southern Blotting. Altre mutazioni Hb: HbC e HbE. Loro
spiegazione da Medicina Darwiniana: resistenza alla malaria di HbS eterozigote, HbC omozigote. Studio evolutivo Homo sapiens:
teoria “out of Africa”, Eva-mitocondriale ed ereditarietà dell ‘Y. Spiegazioni evolutive per l’assenza del DNA spermatico
mitocondriale. Co-evoluzione mutazioni Hb, Plasmodium falciparum e Anopheles Gambiae: passaggio da hunters-gatherers a
popolazioni stanziali (pascolo-agricoltura) in Medio Oriente (Mesopotamia) circa 10.000 BC. L’anemia falciforme: primi studi di
Vernon Ingram e Linus Pauling. Sequenziamento proteine (tecnica elaborata da Fred Sanger). Determinazione HbS (Glu- Val)
mediante dot blot (sonde ASO).
Importanza della Darwinian Medicine (DM), per spiegare mutazioni Hb-S,
Transizioni/transversioni. Studi di YW Khan identificano RFLP (MstII) su HbS (frammenti da 1.1, 0.2 e 1.3) lavoro su journal
Science, 1976) Altri RFLPs (HpaI) associati casualmente (pedigree) ad HbS (frammenti da 13 e 7.6 kb). Struttura genomi:
genoma umano e principi di mappatura basata su polimorfismi (RFLPs, SSLPs, etc.). Effetto fondatore (founder effect), aplotipi
e linkage disequilibrium.
I micro-arrays: loro importanza nella ricerca odierna. Tecnica delle micro-schiere (micro-arrays) permette di paragonare
espressione genica fra due sets di cellule (controllo vs. trattata/patologica/tumorale). Esemplificazione con esperimenti di
Stephen Friend su carcinoma mammario (prognosi in lymphonode negatives). Importante esemplificazione: studi di L. Van’t Veer
21
e Steven Friend ne dimostrano l’importanza, per identificare donne con carcinoma alla mammella –apparentemente con buona
prognosi- ad alto rischio di recidiva.
Differenze fra mappe fisiche e mappe genetiche (principi di mappatura sottostanti).
Principio dell’overlapping
(sovrapposizione). Numero marcatori, distanza media fra loro, multiplex PCR, Contigs e loro assemblaggio. Selezione DNA per
genoteche.
13° lezione : VENERDI’ 17 MAGGIO 2013 (last lecture).
REGISTRO: 1. Il Genoma Umano: fase finale. The race: la gara fra Craig Venter (Celera genomics) e Jim Watson
(Consortium HUGO). Marcatori: RFLPs, VNTRs, EST, STS, STR
2.
Tecniche di Sequenziamento: S454, Illumina,
Pyrosequencing, George Church.
Jonathan Rothberg: lo Steve Jobs del sequenziamento: Ion Torrent. 3. Evoluzione
H. sapiens. Clonazione/studio di oncogeni e geni oncosoppressori di importanza fondamentale. Src, Myc, Myc-IgH,
Bcr-Abl, HER2 (neu), RB, gleevec = CML etc., A. Jolie ed i geni BRCAs.
Tecnica di Maxam e Gilbert: sequenziamento con metodo di Gilbert mediante degradazione chimica. Tecnica di Sanger e
Soulston mediante il metodo con dideossinucleotidi (chain termination: relativa importanza, vantaggi, praticità). Necessità e
metodiche per ottenere singole eliche specifiche da sequenziale (M13, PCR con magnetic beads, primers universali ed interni).
Tecnica dell’M13. Tecnica delle metallic beads. Sequenziatori automatici (capillari, fluorocromi diversi). Articolo di George
Church (Scientific American) su Tecnologie innovative per sequenziamneto etc. Pirosequenziamento (una pirofosfatasi
determina la produzione di un quanto e macchine S454 (sequenziamento DNA di J. Watson). Primers universali e specifici.
Sequenziamento automatizzato ed innovazioni tecnologiche per sequenziamento: diversi fluorocromi ed elettroforesi su
capillari. Sequenziamenti ultraveloci: piro-sequenzaimento, sequenziatori S454, genoma di J. Watson e $ 1000 genomes
(personal genomes). Tecnologie futuribili basate sul transito di ssDNA attraverso pori di membrana (nanopore sequencing;
pores = 1.5 nm, variazioni di conduttanza misurati in pA). PCR (Kary Mullis) e utilizzazione per tipizzazione spermatozoi. PCR
quantitative con sonde fluorescenti beacons., fluoro-cromo, quencher, ansa d’ibridazione: importanza per determinazioni
quantitative determinate dal passaggio di una soglia (detectability = approx. 106 molecules), molto utilizzata per determinazioni
cDNA.
22
Esemplificazione/esercizio pedigree ‘Volver’ (Almodovar, simile storia nel film): significato del LOD score (logarithm of
the odds; associazione => 3 non-associazione =< -2).
Introduzione alla GENOMICA. Basi epistemologiche seguendo i principi di falsificabilità di Karl Popper non dimostrano grandi
novità concettuali. Un’interpretazione più consona proviene dal lavoro di Thomas Kuhn su le rivoluzioni scientifiche, quando cioè
si accumulano contraddizioni nella teoria che va per la maggiore. Esempi potrebbero essere la meccanica Galileana che sostituirà
-nella fisica- la visione Aristotelica, ovvero la Teoria Relativistaica di Einstein che andrà a modificare la meccanica Newtoniana.
Secondo la visione di Gunther Stent, questa fase corrisponderebbe probabilmente a quella “accademica” della Biologi
Molecolare.
Il Progetto Genoma Umano parte con il piede sbagliato (A wrong start): il telescopio Keck della Univ. California Santa Cruz ed il
dirottamento dei fondi da parte di R. Sinsheimer verso il progetto per i genomi.
Genoma Umano (HGP): Fasi/protagonisti iniziali del HGP (R: Sinsheimer, C. De Lisi, R. Dulbecco, B. Alberts, J. Wyngaarden, J.
Watson, W. Gilbert). R. Dulbecco: “A turning point in cancer research”. Opposizioni (Baltimore, Weinberg, Botstein).
Presidenza Watson ed istituzione del centro ELSI (Ethical Legal Social Issues): problemi etici e di confidenzialità
(esemplificazione con Chorea di Huntington). Problema delle sequenze ripetute all’interno del genoma umana, in quanto la
mappatura si basa in gran parte sulla sovrapponibilità (esemplicazione con LINE e SINE –ad es. sequenze ALU, oltre 106 copie
nel genoma umano). Animazione di Roy Britten e David Cohen (già presentata durante il corso) su struttura generale dei genomi
e sequenze ripetitive (DNAftb). Grafici CoT e RoT (eluzione su colonne idrossiapatite) distinguono sequenze semplici (poly U:A)
da genomi batterici (E. coli) e da genoma umano (curva trifasica): ibridazione con mRNA radioattivo. Calcolo dimensioni genomi,
numero geni, dimensioni medie di un gene, dimensioni medie di una proteina codificata dal gene. Sidney Brenner e progetti
alternativi basati su cDNA. Difficoltà sequenziamento genoma umano. Mappatura con ibridi somatici uomo-topo: perdono
tipicamente i cromosomi umani (SCH, ottenuti con Virus Sendai inattivato), ad es. : gene TK, (vedi esperimenti di M. Wigler e R.
Axel utilizzando terreno HAT). SCH permettono di mappare in questo caso TK sul cromosoma umano 17. Marcatori polimorfici
RFLP (Botstein, Davis, Skolnick, White, già esemplificati con mutazione HbSS: identificazione RFLP (Mst-II) su sito
mutazione Hb-S da Y-W Kan; altri siti RFLP associati a HB-SS (Hpa-I)- discussione su significato RFLP in diversi
pedigrees (founder effect)), SSLPs, STR, STS, VNTR, etc: primi tentativi di mappe genomiche con marcatori SSR e micro
23
satelliti (Cohen, Weissenbach/ Genethon e Cooperative Human Linkage Center). Aumento sequenze depositate negli anni 199199.
Linea strategica di JD Watson: ottenere inizialmente una buona mappatura del genoma umano (si scontrerà con la Direttrice
dell’NIH, Bernadette Healey e rassegnerà le dimissioni da Direttore del HGP). Identificazione locus DMD. Esemplificazione
con vari pedigree e RFLPs (BglII 8kb, 22kb, 30kb) per arrivare al locs DMD. Ipotesi di Mary Lyon e traslocazioni con
autosomi (Xp21;21p12). Strategia di T. Monaco, J. Gusela e L. Kounkel per clonare il gene da DNA di Bruce Breyer (DMDsonicato) e DNA tetraploide per X (digestione con Mbo-I). Eccesso di DNA-BB (con vasta delezione) per arricchire le
sequenze rilevanti (3 possibili ibridazioni fra molecole). Isolamento di una sonda specifica, successivo clonaggio di cDNA
ed esecuzione di exon mapping. Clonazione gene mucoviscidosi (CF: F. Collins e L-C. Tsui). Passeggiate e salti sul
cromosoma (chromosome walking and chromosome jumping - utilizzazione vettore mutante SupF). Mutazione caratteristica
D-508 Genetica inversa, clonazione posizionale. Espansioni di trinucleotidi in varie patologie umane: Chorea di Huntigton e
Sindrome Fragile-X (sindromi da espansione di 3N). Mappe genetiche e fisiche: differenze e significato. Clonazione regioni
con ripetizioni. Mappatura per co-presenza di STS. Fingerprinting di cloni BAC per la loro identificazione. Radiation hybrids
(RH), ottenuti con Sendai Viris o polyethylenglycol, dopo aver trattato il DNA umano con radiazioni ionizzanti. Sprint finale per
la conclusione del Progetto Genoma Umano (HGP): complementarietà fra le due strategie, quella clone-by-clone della Consortium
degli Enti di Ricerca e quella del Whole Genome Shot-gun (WGSG) Sequencing effettuata dalla Celera Genomics guidata da
Craig Venter.
Identificazione di oncogeni con tecniche di trasfezione in cellule di topo NIH-3T3 (Robert Weinberg, Mariano Barbacid,
Michael Wigler, Jeffrey Cooper): identificazione iniziale e purificazione delle sequenze umane con sonde Alu. Ulteriori passaggi
per trasfezione (2aria, 3aria). Clonazione in vettore lambda e caratterizzazione con sonde v-onc.s. Omologia con v-ras,
identificazione mutazione puntiforme mediante tecniche taglia-cuci ed infine con sequenziamento. Ruolo della mutazione
attivante ras: inattivazione GTPase.
Simili alterazioni nella malattia di Von Recklinghausen/Neurofibromatosi I (gene Gap).
Carcinogenesi da inserzione di promotore e di enhancer dovuti a virus ad infezione cronica (“promoter insertion”S. Astrin e W.
Hayward). Importanza regolazione da LTR. Simili effetti enhancer nelle leucemie umane linfoidi (oncogene myc nel linfoma di
Burkitt’s associato ai loci Ig: H e L: 8;14/2;14/14;22) e mieloidi (CML: 9;22/ bcr-abl). Farmaci bersaglianti traslocazioni
Filadelfia (abl TK) e loro resistenza: gleevec. Carrellata Oncogeni/Oncosoppressori: Oncogeni virali: RSV e SV-40 (Dulbecco,
24
Baltimore, Temin). Oncosoppressore RB in retinoblastoma (Alfred Knudson, Steven Friend, Ed Harlow). Oncogene da
retrovirus (Michael Bishop e Harold Varmus). Oncogeni da tumori umani (R. Weinberg, M. Wigler, M. Barbacid e J. Cooper).
Libro di testo: DNA Ricombinante di J.D. Watson, Caudy, Meyers and Witowski Ed. Zanichelli, 2008. Oltre agli argomenti
trattati a lezione, vanno presentati per intero –oltre ai capitoli delle parti presentate a lezione (1-6), i seguenti Capitoli: 11,
14 e 15.
Libri di Consultazione consigliati: --- JD Watson: Molecular Biology of the Gene 6th Edition. Traduzione Italiana Zanichelli
--- Michael Cox: Molecular Biology -- Priciples and Practice Traduzione Italiana Zanichelli
25