metodi rapidi ed efficienti per l`estrazione di oli minerali
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metodi rapidi ed efficienti per l`estrazione di oli minerali
Metodi rapidi ed efficienti per l’estrazione di oli minerali (MO) da imballaggi di cartone e alimenti Sabrina Moret, Marianna Scolaro, Laura Barp, Giorgia Purcaro, Lanfranco S. Conte Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università degli Studi di Udine, Via Sondrio 2A, 33100, Udine, Italia 26-28 giugno 2013 Desenzano del Garda [email protected] Oli minerali (MO) Prodotti ottenuti dalla distillazione frazionata e raffinazione del petrolio Si tratta di miscele complesse di idrocarburi che non possono essere separati individualmente e che danno tipici tracciati cromatografici caratterizzati dalla presenza di “colline” di picchi non risolti. E’ importante distinguere: MOSH (mineral oil saturated hydrocarbons) che comprendono idrocarburi lineari e ciclici (n-alcani, isoalcani e cicloalcani). MOAH (mineral oil aromatic hydrocarbons) principalmente con 1-4 anelli, alchilati Tossicità degli oli minerali La tossicità dei MOSH dipende dalla distribuzione dei PM. Si accumulano in tessuti animali, latte e grasso umano. A dosi comprese tra 0,01-20 mg/kg p.c. causano lo sviluppo di granulomi al fegato e lesioni ai linfonodi mesenterici in ratti Fisher 344. JECFA 2002 Oli minerali media e bassa viscosità (classe III) tADI 0,01 mg/kg p.c. SML (Specific Migration Limit) 0,6 mg/kg alimento (60 kg p.c. e 1 kg/giorno) JECFA 2012 : ritirata tADI per mancanza di dati Opinione EFSA 2012: • La presenza di oli minerali negli alimenti ha molteplici fonti • Sono necessari ulteriori studi per valutare potenziale accumulo e tossicità MOSH • Non dovrebbero essere presenti MOAH negli alimenti Limiti di legge Nel 2008 UE stabilisce un limite di 50 mg/kg per olio girasole ucraino BMELV Maggio 2011: bozza ordinanza con limiti per MOSH e MOAH migrati da imballaggi e altri materiali a contatto con alimenti prodotti con carta riciclata: MOSH C10-C25: < 0.6 mg/kg di alimento MOAH C10-25: <0.15 mg/kg (non rilevabile) Maggio 2013: nuova bozza ordinanza da applicare ad alimenti confezionati in carta/cartone riciclato (no carta/cartone vergine) • MOAH C10-25 non devono essere trasferiti agli alimenti • Non viene specificato un limite • Viene indicata necessità utilizzare materiali barriera Oli minerali (MO) MOSH e MOAH presentano tracciati cromatografici con “colline” di picchi non risolti nello stesso range di volatilità MOSH MOAH MOAH (15-25% dei MOSH): comprendono sospetti cancerogeni e genotossici Possibili interferenti: olefine naturalmente presenti nel campione, POSH, PAO MOSH rilevanti ai fini della migrazione in fase gassosa: C10-C25 MOSH rilevanti da un punto di vista tossicologico: C16-C35 BfR: tADI 12 mg/persona/giorno per MOSH C10-C16 Principali fonti di contaminazione • Oli minerali “food grade” trovano largo impiego nell’industria alimentare (ingredienti, agenti anti-polvere, agenti distacco, lubrificanti, agenti rivestimento per frutta, vegetali formaggi, etc.) • Contaminazione ambientale: scarichi di autoviecoli (olio motore incombusto), riscaldamento domestico, uso di alcuni pesticidi, raccolta meccanizzata sono responsabile di contaminazione di fondo di vegetali e prodotti derivati Attenzione recentemente focalizzata su possibile migrazione da imballaggi in cartone riciclato ad alimenti secchi in essi confezionati Determinazione analitica • MOSH e MOAH dello stesso intervallo di volatilità co-eluiscono da colonna GC • Necessaria pre-separazione MOSH/MOAH prima dell’analisi GC • Disponibili a questo scopo metodi off-line e on-line ESTRAZIONE Opzionale (dipende da matrice, sensibilità richesta) PRE-ARRICCHIMENTO Rimozione materiale interferente PURIFICAZIONE (rimozione del grasso) Frazionamento MOSH e MOAH LC-GC-FID OFF-LINE SPE-GC-FID OFF-LINE LC-GC-FID ON-LINE DEPT. FOOD SCIENCE, UNIVERSITY OFITALY UDINE, ITALY UNIVERSITY OF UDINE, Metodo LC-GC on-line LC-GC 9000 Metodo LC-GC on-line “veloce” MetodoBarpLC-GC on-line “veloce” et al., J. Sep. Sci. (in press) "Reference Method" "Fast Method" Improvement Run Time 35 min 23 min - 12 min or 34% C6 volume 8 mL 5 mL - 3 mL or 23% Cl2CH2 volume 4.5 mL 4.5 mL = “Fast Method”: 2.6 samples/h 62 samples/24h “Reference Method”: 1.7 samples/h 40 samples/24h Metodi SPE-GC off-line Metodo SPE-GC off-line Moret, et al., J. Chromatogr. A 2012, 1243, 1-5 250uL sample 1mL C6 (dead volume) 1,5 mL C6 + 0,5mL C6/CH2Cl2 (1:1) MOSH 0,5mL C6/CH2Cl2 (1:1) 1g silvered silica packed and conditioned 7mL C6/CH2Cl2 (1:1) MOAH reconcentration MOSH MOAH LVI – GC- FID Estrazione Metodi tradizionali • Estrazione classica con solvente • Idrolisi acida • Saponificazione Metodi innovativi • Saponificazione assistita con le microonde (MAS) • Estrazione assistita con le microonde (MAE) • Estrazione liquida ad alta P e T (PLE) Estrazione classica con solvente di MO dal cartone Metodo SE (Lorenzini et al., 2010) 1 g cartone (tagliato in piccoli pezzi) + IS + 10 mL esano/etanolo (1:1) (2h at T amb) 3 mL estratto + 6 mL H2O Vortex Centifugazione Iniezione Lorenzini et al. 2010 Sample preparation On-line LC-GC Results MOSH MOSH PLE Mineral oil in food packaging (cardboard, paper) 22 cycles cycles 1 cycle cycle++wash wash 1 PUMP FID 1° cycle 1 cycle 2°cycle cycle 2° 3°cycle 3° cycle HPLC HRGC MOAH MOAH 22 cycles cycles 2° cycle cycle 2° 3°cycle 3° cycle cycle ++wash 1 cycle wash 1° cycle 1 cycle DEPT. FOOD SCIENCE, UNIVERSITY OF UDINE, ITALY Pressurized liquid extraction (PLE) In cella da 10 mL: 2 barrette di acciaio (2 mL) + 1 g campione in strisce + IS PLE estratto pronto per l’iniezione Speed extractor (Buchi) Metodo PLE cartone Condizioni testate Condizioni testate: • cella di estrazione: 10 mL • solvente di estrazione: esano, esano/ etanolo (1/1), etanolo (1-2 cicli) • temperatura estrazione: 30-50-60-100 °C • pressione: 100 bar • pre-riscaldamento: 1 min • tempo di estrazione: 5-10 min • scarico solvente: 2 min • lavaggio con solvente: no • flush con azoto: 1 min Lo SpeedExtractor permette di processare fino a 6 campioni in parallelo Metodo PLE cartone Test di recupero su n-alcani e standard interni area Riferimento: Iniezione diretta in LC-GC Flush 1’: Iniezione LC-GC dopo PLE (60 °C x 5’, 100 bar, flush con azoto 1’) 1400 1200 1000 800 REFERENCE 600 FLUSH 1' 400 200 Standard interni e di verifica: MOSH C11 CyCy (cicloesil cicloesano) C13 CHO (colestano) MOAH 5B (n-pentil benzene 1MN (1-metilnaftalene) 2MN (1-metilnaftalene) TBB (tri-ter-butil benzene) 0 C10 C12 C14 C16 C18 C20 C22 C24 C26 C28 C30 C32 C34 C36 C38 C40 area 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 REFERENCE FLUSH 1' C11 CyCy C13 Cho 5B 1-MN 2-MN TBB Con un flush di azoto di 1 min (necessario a scaricare solvente residuo dalla cella) non si osservano perdite né di n-alcani più volatili, né di standard interni. Ottimizzazione metodo PLE cartone Scelta del solvente di estrazione Testati 3 diversi solventi (1 ciclo, 60°C, 5 min): • esano • etanolo • esano/etanolo (1:1) Non si osservano differenze apprezzabili per MOSH<C24 e per MOAH. Il minore potere estraente dell’etanolo nei confronti di MO basso bollenti, osservata per il metodo Lorenzini non viene confermata con il metodo PLE possibilità di utilizzare solo esano (no post trattamento campione) Hexane/ethanol (1:1) ethanol hexane Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252 Ottimizzazione metodo PLE cartone Scelta del solvente di estrazione In figura sono riportati i tracciati LC-GC ottenuti estraendo un campione di cartoncino riciclato non stampato (viola) e stampato (blu) con solo esano e con miscela esano/etanolo (1:1). I 2 solventi mostrano selettività comparabili. Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252 Ottimizzazione metodo PLE cartone Effetto temperatura e tempo di estrazione MOAH MOSH 60-70 °C 60-70 °C 30 °C 30 °C Le rese di estrazione (1 ciclo, esano, 5 min, 100 bar) aumentano con la T passando da 30°C a 60°C (a 30°C vengono estratti circa 80% dei MOH presenti). Non si osservano ulteriori incrementi della resa di estrazione tra 60°C e 70°C. Non si osservano differenze apprezzabili aumentando tempo di estrazione da 5 a 10 min. Ottimizzazione metodo PLE cartone Numero cicli di estrazione e recupero Testati 4 cartoncini diversi di cui 2 dello stesso tipo ma diverso spessore: 1 ciclo estrazione recuperi MOSH compresi tra 76 e 100% 2 cicli estrazione recuperi praticamente quantitativi per tutti e 4 i campioni. Le rese di estrazione con 1 ciclo sono influenzate dallo spessore del cartoncino. La figura mostra i tracciati LC-GC ottenuti per un campione con 2 cicli consecutivi (blu), 1 ciclo (viola), 2° ciclo separato (verde), 3° ciclo separato (marrone), 1 ciclo + lavaggio con esano (nero). MOSH MOSH 22 cycles cycles 1 cycle cycle++wash wash 1 1° cycle 1 cycle 2°cycle cycle 2° 3°cycle 3° cycle MOAH MOAH 22 cycles cycles Per ottenere rese quantitative e indipendenti dal tipo di cartoncino sono necessari 2 cicli di estrazione 2° cycle cycle 2° 3°cycle 3° cycle cycle ++wash 1 cycle wash 1° cycle 1 cycle Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252 Ottimizzazione metodo PLE cartone Ripetibilità (n=8) MOSH MOAH RSD<5% sia per MOSH che per MOAH (8 repliche effettuate su campione cartone riciclato non stampato) Metodo PLE cartone Confronto con metodo SE I profili LC-GC ottenuti con PLE ottimizzato risultano perfettamente sovrapponibili a quelli ottenuti con metodo SE (Lorenzini et al., 2010) Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252 Metodo PLE cartone Applicazione metodo PLE e confronto con metodo SE Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252 Metodo PLE cartone Condizioni ottimizzate Vantaggi metodo PLE: • minor manipolazione campione, risparmio tempo (6 campioni in parallelo in meno di 30 min) • non è necessario alcun post-trattamento dell’estratto prima dell’iniezione Estrazione da alimenti secchi a basso contenuto di grasso confezionati in imballaggi di cartone • I MO migrati dall’imballaggio tendono a rimanere in superficie per cui risultano facilmente estraibili con solvente apolare • la contaminazione pre-esistente (che può avere diverse origini) risulta più fortemente inclusa nella matrice e quindi più difficilmente estraibile (necessità di utilizzare idonea miscela di solventi) Sono stati ottimizzati 2 metodi PLE 1) PLE-A: per estrazione MO migrati dall’ imballaggio 2) PLE-B per estrazione MO totali da diverse fonti di contaminazione Metodo PLE-A (MO migrati dal packaging) Preparazione del campione Pastina, riso o altri cereali in grani (circa 8 g) vengono caricati direttamente in cella di estrazione da 10 mL cell (non si utilizzano agenti disperdenti). Pasta di formato più grande deve essere ridotta in pezzi grossolani. Condizioni testate • Solvente di estrazione: esano (1-2 cicli) • Temperatura di estrazione: 80-100-120 °C • Pressione: 100 bar • “Heat up”: 1 min • Tempo di estrazione (hold time): 5-10 min • Scarico: 2 min • Lavaggio con solvente: no - si (2 mL/min x 180’’) • Lavaggio con azoto: 2 min Metodo PLE-A Ottimizzazione dei parametri di estrazione Non si osservano differenze di estrazione significative al variare della temperatura (80-100-120°C) e del tempo di estrazione (5-10 min). I recuperi ottenuti con 1 ciclo di estrazione (5 min a100 °C) non sono quantitativi. Un lavaggio con esano effettuato alle fine dell’estrazione permette di ottenere recuperi praticamente quantitativi Pasta semola dopo 3 mesi di contatto con cartone riciclato Metodo PLE-A 1 ciclo esano + lavaggio con solvente 2° ciclo di estrazione Tracciati LC-GC ottenuti a 80, 100 and 120 °C for 5 min e a 100 °C for 10 min (1 ciclo) Metodo PLE-A (Ripetibilità n=6) MOSH MOAH RSD<5% Sopraposizione di 6 repliche di analisi dello stesso campione di pasta dopo contatto (9 mesi) con cartone riciclato Metodo PLE-A Condizioni ottimizzate metodo PLE-A Speed Extractor E-916 (6 positions) Temperature 100 °C Pressure 100 bar Cells (volume) 10 mL Solvent hexane Cycles (number) 1 - Heat up 1 min - Hold time 5 min - Discharge 2 min Flush with solvent 180’’ at 2 mL min-1 Flush with gas (N2) 1 min Total solvent consumption 13 mL Total extraction time < 20 min (wash included) Moret et al., 2013 (submitted) Il metodo PLE-A permette estrazione quantitativa degli idrocarburi migrati dall’imballaggio ad alimenti secchi a basso contenuto di grasso (pasta semola, riso, cereali in grani). L’estratto può essere iniettato direttamente previa eventuale centrifugazione Per ottenere estrazioni quantitative di MOSH e MOAH da campioni di pasta all’uovo è necessario allungare i tempi di estrazione Estrazione di MO totali L’estrazione di MO totali dagli alimenti può risultare più o meno difficoltosa in funzione della natura dell’alimento Metodi disponibili a questo scopo: Metodo Biedermann-Brem e Grob (2010): trattamento con acqua calda (1h a 80°C) seguito da estrazione con etanolo (1h) e poi con esano (overnight) lavaggio estratti combinati con acqua (applicata a pasta) Idrolisi acida (applicata a latte in polvere) Saponificazione (tradizionale) Questi metodi richiedono lunghi tempi di estrazione ed elevati consumi di solvente La PLE rappresenta una interessante alternativa Metodo PLE-B (MO totali) Preparazione del campione: Campione finemente macinato. La cella di estrazione viene riempita (dal basso) con un letto di sabbia (5 g), 2 g di campione mescolato a sabbia (6 g), addizionato con IS e riempito di sabbia lasciando in testa alla cella un volume vuoto di circa 1 mL. Condizioni testate • Solvente di estrazione: esano, etanolo, acetone, esano/etanolo (1:1), esano/acetone (1-2-3 cicli) • temperatura di estrazione: 100-120 °C • Pressione: 100 bar • Heat up: 1 min • tempo di estrazione: 5-10 min • Scarico: 2 min • Lavaggio con solvente: si/no • Flush con azoto: 2 min Metodo PLE-B (MO totali) Scelta del solvente di estrazione hexane/ethanol (1:1) hexane acetone hexane/acetone (1:1) 8 12 min Moret et al, 2013 (submitted) La miscela esano/etanolo da le rese di estrazione più elevate. Metodo PLE-B (MO totali) Temperatura di estrazione 100 -120°C 150°C A 150 °C si osserva un imbrunimento del campione e una leggera diminuzione della resa di estrazione. Metodo PLE-B (MO totali) Numero cicli ed efficienza di estrazione 1° cycle 2° cycle 3° cycle 8 12 min Moret et al, 2013 (submitted) 4 Per ottenere rese quantitative è necessario effettuare 2 cicli di estrazione. Prove effettuate in triplice su 3 campioni con diversi profili di contaminazione hanno evidenziato recuperi superiori al 95% Metodo PLE-B (MO totali) Confronto metodo PLE-B – estrazione classica con solvente PLE method B hexane/ethanol 1:1 soaking with hot water + ethanol extraction (1h) hexane extraction overnight hexane extraction overnight 4 Moret et al., 2013 (submitted) 8 12 16 min Il metodo PLE-B da risultati confrontabili a quelli ottenuti con metodo proposto da Biedermann-Brem e Grob, e permette di ridurre tempi di analisi, consumo di solventi e manipolazione campione Metodo PLE-B (MO totali) Ripetibilità 6 repliche effettuate con il metodo ottimizzato su 2 campioni con diverso livello di contaminazione pre-esistente: livello basso (0.8 mg/kg) e livello alto (13.7 mg/kg) hanno evidenziato una buona ripetibilità (RSD< 6%) 0.8 mg/kg 13.7 mg/kg Metodo PLE-B Condizioni ottimizzate metodo PLE-B Speed Extractor E-916 (6 positions) Temperature 100 °C Pressure 100 bar Cells (volume) 10 mL Solvent Hexane/ethanol 1:1 (v/v) Cycles (number) 2 - Heat up 1 min - Hold time 5 min - Discharge 2 min Flush with solvent no Flush with gas (N2) 1 min Total solvent consumption 15 mL Total extraction time 28 min Moret et al., 2013 (submitted) Post-trattamento campione L’estratto raccolto in vial (da 60 mL) viene addizionato di acqua per allontanare l’etanolo. Una sosta di 15-20 min a -20 °C permette di evitare la centrifugazione per separare la fase esano (che può essere iniettata direttamente o previa concentrazione) Esempio di applicazione metodo PLE cartone e metodo PLE-A MOSH MOAH 3 diversi alimenti, stesso formato (riso, riso parboiled, pastina semola) a contatto con 2 diversi cartoni (6 settimane a T ambiente) livelli di migrazione comparabili per le 2 tipologie di riso, sensibilmente più bassi per pastina semola Esempio di applicazione combinata dei metodi PLE-A e PLE-B PLE-Ain ecampioni PLE-B (1) pasta semola PLE A PLE A a b MOSH MOAH Migrated from packaging T9 PLE-B estrae MO totali T1 T9 T1 T0 T0 PLE B (total contamination) c PLE B after PLE A d MOSH T9 MOSH Pre-existing contamination T1 T9 T1 T0 4 Moret et al., 2013 (submitted) 8 PLE-A permette di estrarre selettivamente MO migrati da packaging T0 12 8 12 min Applicando in successione PLE-A e PLE-B (su campione previamente macinato) è possibile evidenziare contaminazione preesistente anche in presenza di contaminazione da imballaggio Estrazione con le microonde Estrazione con le microonde Microwave Assisted Saponification (MAS) 5g campione macinato + 10 mL KOH in CH3OH + 10 mL esano Microwave Assisted Extraction (MAE) 5g campione macinato + 10 mL esano/etanolo 1:1 120 °C x 20 min Lavaggio con acqua dell’estratto esanico LC-GC-FID on-line SPE GC-FID off-line H (2 cicli) - 20 LUGLIO Confronto metodi: PLE-B / MAS / MAE in campioni di pasta di semola PLE-B MAS MAE Applicazione Applicazionemetodo metodoMAS MASaacampioni campionicon conelevato elevato contenuto contenutodidigrasso grasso Latte in polvere Omogenizzato al formaggio Biscotto 1 Il metodo MAS rappresenta la scelta migliore per l’estrazione di MO da alimenti ad elevato contenuto di grasso. Biscotto 2 Migliorano limiti di rilevabilità, si allungano i tempi di vita delle colonne Conclusioni L’estrazione degli analiti dal campione rappresenta una fase importante della determinazione analitica e va opportunamente ottimizzata in funzione della natura della matrice e delle finalità da raggiungere Recentemente sono stati sviluppati diversi metodi di estrazione basati sull’impiego di tecniche innovative (PLE, MAE, MAS) In particolare sono stati sviluppati e applicati un metodo PLE per estrazione MOSH e MOAH da carta e cartone, un metodo PLE per estrazione selettiva di MOSH e MOAH da alimenti secchi a basso contenuto di grasso, un metodo PLE per l’estrazione MOSH e MOAH totali e un metodo MAS particolarmente idoneo al trattamento di campioni con un elevato contenuto di grasso Grazie per l’attenzione UNIVERSITY OF UDINE, ITALY